Name: Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-11T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie ein 3D-in-vitro-System zur Modellierung von Tumorzell-Dormanz und dem Übergang zu metastatischem Wachstum aufgebaut wird. Diese Methode ermöglicht Echtzeit- und Hochdurchsatzanalysen zur Untersuchung von Mechanismen der Metastasierung.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Interne Research Program des National Cancer Institute unterstützt.

1. Zellkultur Wartung der ruhenden und metastasierten Tumor-Zelllinien <ol><li> Wachsen ruhenden (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) und metastasierenden Tumorzellen (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) in 10 cm Petrischalen mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) hohen Glucose und 10% fötalem Rinderserum ( FBS) und Antibiotika. Sobald die Zellen 70-80% Konfluenz erreichen, um die folgenden Assays gehen. </li></ol> 2. Zellproliferationsassay ruhender (Ruhe) und metastasierten (wuchernde) Tumorzellen in einer 3D-BME-System kultiviert Die Kultivierung ruhenden / metastatischen Zellen im 3D-System <ol><li> Thaw Cultrex growth factor-reduzierten Basalmembran-Extrakt (BME) in 4 ° C Kühlschrank eine Nacht vor der Durchführung der Tests. Beachten Sie die BME auf Eis sollte zu jeder Zeit behandelt werden. </li><li> Am folgenden Tag, Ort, eine 96-Well-Platte auf einem Tablett mit Eis in einen laminaren Haube. Coat jede Vertiefung mit 50-100 &amp;mgr; eiskaltem BME mit einem Spender mit einer Spritze. Achten Sie darauf, keine Blasen in den Vertiefungen gebildet werden. Platzieren Sie den 96-Well-Platte mit BME in einem befeuchteten Inkubator beschichtet mit 5% CO 2 bei 37 ° C für 30 Minuten. </li><li> In der Zwischenzeit absaugen Medien aus dem ruhenden und oder metastasierende Tumorzellen (hergestellt in Abschnitt 1). Spülen Kultur-Platten mit 10 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS). Saugen Sie das PBS und fügen 2ml Trypsin bei 37 vorgewärmten ° C, um die Kultur-Platten. Die Inkubation in einer feuchten 5% CO 2 bei 37 ° C, für 5 min. </li><li> Transfer-Zellen auf eine 15 ml konische Röhrchen mit 5 ml DMEM high glucose mit 10% FCS und Antibiotika ergänzt und zählen Sie die Zellen. </li><li> Spin down die gesamte Zellzahl in einer Gewebekultur Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von 1500g kultiviert werden, bei Raumtemperatur für 5 min. In unseren Tests haben wir bereiten 2X10 3 Zellen / well für jede Zelllinie oder Zeitpunkt untersucht werden. Dies kann jedoch in Abhängigkeit von den verwendeten Zelllinien. </li><li> Vorsichtig absaugen des Überstandes. Beachten Sie, in den meisten Fällen das Pellet nicht sichtbar ist. Daher lassen einige Medien hinter sich. Tippen Sie auf der Unterseite der 15ml konischen Rohr mit den Fingern, um sicherzustellen, dass eine Suspension von Einzelzellen gewonnen wird. Re-suspend das Pellet mit DMEM niedrige Glukose mit Antibiotika ergänzt mit 2% FCS + 2% BME (Assay Medien). 100 ul des Assays Medien sollten für jeden 2x10 3 Zellen aufgenommen werden. Man reibt die Zellen oft mit einer 5ml Pipette, um sicherzustellen, dass eine einzelne Zelle Suspension gehalten wird. </li><li> Platte eine 100 &amp;mgr; der Zelle Mischung pro Vertiefung auf der Oberseite des 96-Well-BME beschichtete Platte. Für Hintergrundinformationen Evaluierung (in Abschnitt 2.8) Platte zusätzlich 100 &amp;mgr; pro Well nur den Assay Medien auf der Oberseite des 96-Well-BME beschichtete Platte. Inkubieren Sie die kultivierten 96 Well-Platten in einem befeuchteten 5% CO 2-Inkubator bei 37 ° C. Die Zellen sollten alle wieder zugeführt 4 Tage mit dem Test-Medien. </li></ol> Proliferation Assay: <ol start="8"><li> Proliferationsassay der Zellen: add in die Vertiefungen an den gewünschten Zeitpunkten 20 ul der Zellzahl 96 wässrige Lösung Cell Proliferation Assay-Kit. Inkubieren in einer befeuchteten 5% CO 2-Inkubator bei 37 ° C für 2h. Mit einem ELISA-Plate Reader Aufzeichnung der Absorption bei 490nm. Für Hintergrundinformationen Evaluierung und Subtraktion, addieren 20 &amp;mgr; l des Cell Titer 96 wässrige Lösung Cell Proliferation Assay-Kit, um Brunnen vor beschichtet mit BME und nur mit Assay-Medium überlagert. Mit einem ELISA-Plate Reader Aufzeichnung der Absorption bei 490 nm. </li></ol> 3. Immunfluoreszenzfärbung für die Zell-Signalmolekülen in ruhenden (Ruhe) Tumorzellen und / oder metastasierten (wuchernde) Tumorzellen Die Kultivierung ruhenden / metastatischen Zellen im 3D-System für Immunfluoreszenz-Färbung * Das folgende Protokoll ist eine Modifikation eines 3D-Kultur-Protokoll von Debnath J et al 18 veröffentlicht. <ol><li> Bereiten BME, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Am nächsten Tag: Ein 8-Kammer-Objektträger aus Glas, das auf einem Tablett mit Eis in einen laminaren Haube. Coat jede Vertiefung mit 50ul eiskaltem BME mit einem 200 ul Pipetman. Stellen Sie sicher, BME gleichmäßig verteilt und keine Blasen in den Vertiefungen gebildet. Legen Sie die 8 Kammern Objektträger aus Glas mit BME in einer befeuchteten 5% CO 2 beschichtet bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Ernte in Vegetationsruhe befinden und oder metastatischen Zellen aus Abschnitt 1 und zur Vorbereitung der Kultur, wie in Abschnitt 2,3 bis 2,4 beschrieben. Sammeln Sie die Gesamtzahl der Zellen in einem 15 ml konischen Rohr kultiviert werden. Wir bereiten 5 x10 3 Zellen / well für jede Zelllinie und Zeitpunkt untersucht werden. Spin down die Zellen in einer Gewebekultur Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von 1500g, bei Raumtemperatur für 5 min. Saugen Sie den Überstand vorsichtig. Beachten Sie, dass das Pellet nicht sichtbar ist, daher lassen einige Medien hinter sich. Tippen Sie auf der Unterseite der 15ml konischen Rohr mit den Fingern, um sicherzustellen, dass eine einzige erhaltene Zellsuspension wird.Re-suspend das Pellet mit Assay-Medium. 400μl des Assay Medien sollten für jeden 5x10 3 Zellen aufgenommen werden. Man reibt die Zellen mehrfach mit 5 ml Pipette. Dieser Schritt ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die einzelne Zelle Suspension gehalten wird. </li><li> Platte 400μl der Zelle Mischung pro Vertiefung auf der Oberseite eines jeden der 8 Kammern mit BME beschichtet. Inkubieren Sie die kultivierten 8 Kammern Objektträger aus Glas-System in einem befeuchteten 5% CO 2-Inkubator bei 37 ° C. Die Zellen sollten alle wieder zugeführt 4 Tage mit dem Test-Medien. </li></ol> Immunfluoreszenzfärbung: <ol start="4"><li> Bei der gewünschten Zeitpunkten, saugen die obere Schicht der Medien und fügen 200 ul der Fixateur mit 4% Paraformaldehyd (PFA), 5% Saccharose und 0,1% Triton X-100 und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Saugen Sie das Fixativ und fügen 200 ul von 4% PFA mit 5% Saccharose und Inkubieren bei Raumtemperatur für 25 Minuten. </li><li> Saugen Sie das Fixativ, fügen Sie 400 ul der Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) in jede Vertiefung. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugen Sie das PBS und geben Sie 400 μ PBS mit 0,05% Tween 20 für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Blockieren Sie die fixierten Zellen bei Raumtemperatur mit 200 ul von entweder 10% Esel Serum oder mit 3% BSA für 1 Std. (Blocking-Lösung verwendet werden empirisch sollte für jeden primären Antikörper bestimmt werden). </li><li> Absaugen der Blockierungslösung und fügen 200 ul des primären Antikörpers (Verdünnung sollte empirisch für jede primäre Antikörper verwendet werden ermittelt werden). Verdünnen Sie den Primärantikörper in 10% Esel-Serum, wenn 10% Esel-Serum für die Sperrung verwendet wurde oder verdünnten Primärantikörper in 3% BSA, wenn 3% BSA blockiert Lösung verwendet wurde. Inkubieren mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Absaugen des Antikörpers, waschen Sie die Platte mit 400μl PBS für 15 Minuten und zweimal wiederholen. Saugen Sie das PBS und fügen 200 ul der Esel-anti-jeweilige-IgG, konjugiert mit Rhodamin rot (Verdünnung sollten empirisch ermittelt werden), decken die 8 Chamber Slide mit Alufolie und inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Wells mit 400μl PBS (3x15 Minuten pro Waschgang). Absaugen PBS. Montiert mit Vectashield Eindeckmedium mit DAPI. Dry Folien für 40 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dias können für 1 Woche bei 4 ° C aufbewahrt werden Bewahren Sie die Folien in der Dunkelheit. Bild gleitet durch konfokale Mikroskopie. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für eine Verbreitung Analyse der ruhenden D2.0R und metastatischen D2A1 Tumorzellen in der 3D-Kultur ist in Abbildung 1A dargestellt. D2.0R Zellen sind ruhende (Ruhe) durch den gesamten experimentellen 14 Tage Kultur Periode, während der hoch metastatischen D2A1 Zellen nur für vier Minuten vor sechs Tagen, nach denen sie beginnen sich zu vermehren ruhen. Während der ersten Ruhephase, bleiben viele Zellen einsam in der 3-D-Kultur (Abb. 1B; Tag 4), während andere nicht-proliferierende Zellen mehrzelligen Sphäroiden zu bilden. Der Übergang von D2A1 Zellen aus einem ruhenden zu proliferativen Zustand in 3-D-Kultur (Abb. 1B; Tag 12) wird mit dramatischen Veränderungen in der Zellmorphologie verbunden. Daher kann dieser Test verwendet werden, um welchen Faktor zu testen / s kann ruhenden D2.0R Zellen auslösen, von ihren inaktiven Zustand entstehen und welchen Faktor / s kann D2A1 Zellen, um den Übergang zu verhindern von ihren inaktiven Zustand. Abbildung 2 ist ein Beispiel für einen Agenten Verhindern D2A1 Zellen um den Übergang von ruhenden zu einem proliferativen Zustand. Wie in Abbildung 2 dargestellt ist, erhalten Behandlungen D2A1 Zellen mit einem spezifischen Inhibitor der Myosin-Leichtketten-Kinase (ML-7) D2A1 Zellen in einem inaktiven Zustand. Zelluläre Signale in den ruhenden und proliferierenden Tumorzellen in das 3D-System kultiviert werden durch Immunfluoreszenzfärbung für die Zell-Signalmolekülen untersucht werden. Wie in Abbildung 3 dargestellt eine deutliche Steigerung in Myosin Light Chain-Phosphorylierung in D2A1 Zellen (rote Färbung) durch Reorganisation des f-Aktin-Filamente bilden Aktin Stress-Fasern (grüne Färbung) folgte tritt beim Übergang von der Ruhephase (1-4 Tage) Proliferation (Tag 7). Allerdings blockiert Myosin Light Chain Kinase-Aktivität in D2A1 Zellen durch shRNA oder bestimmte Arzneimittel (ML-7) behält D2A1 Zellen in einem Ruhezustand und führt zu einer Hemmung der Myosin-Leichte-Kette-Phosphorylierung und f-Aktin Stress Faser Organisation (Abbildung 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. In vitro Modell zur einsamen Tumorzellen Dormanz und die Umstellung auf Metastasen zu untersuchen. A) Proliferation ruhender D2.0R und metastatischen D2A1 in 3-D Cultrex BME, n = 8 (Mittelwert ± SE). Repräsentative Ergebnisse der drei Experimente (* p ≤ 0,05). B) Lichtmikroskopische Bilder von D2.0R und D2A1 Zellen in 3-D Cultrex BME Vergrößerung x20 kultiviert.Abbildung von Barkan et AL 17 modifiziert. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Verhindern Sie den Schalter von D2A1 Zellen aus dem Schlafzustand (Ruhe), um die Proliferation in der 3D-Kultur-System durch die Hemmung der Myosin Light Chain Kinase (MLCK). Zeitlicher Verlauf der D2A1 Zellproliferation in 3-D Cultrex BME, n kultivierten = 8 (Mittelwert ± SE). Die Zellen wurden unbehandelt (Kontrolle), oder behandelt mit einem spezifischen Inhibitor der MLCK (ML-7, 5 M) für 48 Stunden zu Beginn der Kultur Tag 5. Abbildung von Barkan et AL 17 modifiziert. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Myosin Light Chain-Phosphorylierung durch f-Aktinreorganisation beim Wechsel von D2A1 Zellen aus dem Schlafzustand zu proliferative Wachstum. D2A1 Zellen wurden in 3-D Cultrex BME am 8. Kammer Glasplättchen kultiviert. Die Zellen wurden fixiert und mit DAPI (blau) für die nukleare Lokalisation, Phalloidin (grün) für f-Aktin und mit einem Antikörper gegen die phosphorylierte Form von Myosin Light Chain (MLC-p) (rot), wie zu verschiedenen Zeitpunkten angegeben. Merge von f-Aktin und MLC-p-Färbung (gelb). Expression von MLC-p wurde während des Übergangs von D2A1 Zellen aus dem Schlafzustand (Tage1-4) auf proliferative Wachstum (Tag 7) von Aktin-Stress Faserbildung (Pfeile), gefolgt erhöht. Die konfokale Mikroskopie, Vergrößerung x63. Weiße Balken entspricht 20 Mikrometer. Abbildung von Barkan et AL 17 modifiziert. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. . Hemmung der Myosin Light Chain Kinase (MLCK) vermittelt f-Aktin Stress Faserbildung in D2A1 Zellen D2A1 Zellen wurden unbehandelt (Kontrolle), oder behandelt mit Inhibitor für MLCK (ML-7, 5 M), für 48 Stunden ab dem Tag der Kultur 5, oder mit Rühr-oder MLCK shRNA behandelt und gefärbt für die phosphorylierte Form von Myosin Light Chain (MLC-p) (rot), f-Aktin (grün) und Zellkerne (blau). Merge von f-Aktin und MLC-p-Färbung (gelb). Die konfokale Mikroskopie, Vergrößerung x63. Weiße Balken entspricht 20 Mikrometer.

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<li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die zugrunde liegenden Mechanismen, die Tumorzellen verbreitet zu halten in einem Ruhezustand oder das Ergebnis in ihrem Übergang zu Metastasen noch weitgehend unbekannt. Dieses Phänomen war extrem schwierig, in menschlichen Patienten 4,12 und einigen präklinischen Modellen wurden entwickelt, um dieses Problem zu beheben studieren. Dennoch haben einige in-vivo-und ex-vivo-Modell für Tumor Dormanz charakterisiert worden (Übersicht in 1,12). Allerdings kann die in-vivo-Modellen für ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> DMEM high glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM niedrigen Blutzuckerwerten </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> Wachstumsfaktor-reduzierten 3-D Cultrex Basalmembran Extract </td><td> Trevigen Inc. </td><td></td><td> Protein-Konzentration zwischen 14-15mg/ml </td></tr><tr><td> D2.0R und D2A1 Zelllinien </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 und K7M2AS1.46 Zellen </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF-7 und MDA-MB-231 Brustkrebszellen </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ein 8 Kammer Objektträger aus Glas-System </td><td> (Lab-Tek, Thermo Scientific) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> Zellzahl 96 wässrige Lösung Zellproliferation Assay-Kit </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield Eindeckmedium mit DAPI </td><td> Vector Laboratories Inc. </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Normale Esel-Serum </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> Elisa Plate Reader </td><td> Bio-Tec </td><td></td><td> Rekord 490nm </td></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss-LSM-510 </td><td></td><td> Vergrößerung x63 </td></tr></tbody></table>

ein in vitro system zur tumor vegetationsruhe und die umstellung auf metastasen study

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Wiederauftreten von Brustkrebs folgt oft eine lange Latenzzeit, in denen es keine Anzeichen von Krebs und Metastasen können nicht klinisch manifest werden erst viele Jahre nach der Entfernung des Primärtumors und der adjuvanten Therapie. Eine wahrscheinliche Erklärung für dieses Phänomen ist, dass Tumorzellen Metastasen ausgesät, sind resistent gegen herkömmliche Therapien, und bleiben für längere Zeit 1-4 ruhend. Die Existenz der ruhenden Krebszellen an sekundären Standorten wurde bisher als Ruhestrom Einzelzellen, dass weder vermehren noch Apoptose 5-7 beschrieben. Darüber hinaus hat dieser Einzelzellen wurde gezeigt, dass aus dem Primärtumor in einem frühen Stadium der Progression der Erkrankung 8-10 verbreiten und aufzuhalten, in dem Patienten Knochenmark, Blut und Lymphknoten 1,4,11 Wachstum verhaftet. Daher das Verständnis der Mechanismen, die Ruhe-oder den Wechsel zu einem proliferativen Zustand zu regulieren ist entscheidend für die Entdeckung neuer Targets und Interventionen, um ein Rezidiv zu verhindern. Allerdings hat der Entschlüsselung der Mechanismen, die die Umstellung von Tumor Dormanz zu Metastasen durch den Mangel an verfügbaren Modell-Systeme behindert. in vivo und ex vivo Modellsystemen zu metastatischen Progression von Tumorzellen Studie wurden zuvor 1,12-14 beschrieben. Allerdings sind diese Modell-Systeme haben nicht in Echtzeit und in einem hohen Durchsatz Weise mechanistische Einblicke in das, was löst die Entstehung des einsamen ruhenden Tumorzellen als Metastasen wuchern zur Verfügung gestellt. Vor kurzem haben wir ein 3D-in vitro-System entwickelt, um die in vivo Wachstum Eigenschaften von Zellen, die entweder ruhend (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) oder proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatischen Verhalten zeigen Modell in vivo. Wir haben gezeigt, dass Tumorzellen, Dormanz weisen in vivo an einem metastasierenden site Ruhe bleiben, wenn in einem 3-Dimension (3D) Basalmembran-Extrakt (BME) kultiviert, während Zellen hoch metastatischen in vivo leicht in 3D-Kultur vermehren, nachdem variable, aber relativ kurze Ruheperioden. Wichtig ist durch die Nutzung der 3D-in vitro-Modell-System haben wir gezeigt, zum ersten Mal, dass die ECM Zusammensetzung eine wichtige Rolle bei der Regulierung, ob ruhenden Tumorzellen führt zu einer proliferativen Zustand wechseln und haben bestätigt, diese in in-vivo-Studien 15-17 spielt. Daher bietet das Modell-System in diesem Bericht beschriebenen In-vitro-Methode zur Modellierung Tumor Dormanz und studieren den Übergang zu proliferative Wachstum durch die Mikroumgebung induziert.

Eine modifizierte 3-D in vitro-System vorgestellt, bei der Wachstumseigenschaften von mehreren Tumorzelllinien in rekonstituierte Basalmembran mit dem ruhenden oder proliferative Verhalten der Tumorzellen in einer metastatischen sekundären Standort korrelieren<em&gt; In vivo</em&gt;.

Ein In Vitro System zur Tumor Vegetationsruhe und die Umstellung auf Metastasen Study

Das Wiederauftreten von Brustkrebs erfolgt häufig nach einer langen Latenzperiode, in der keine Anzeichen von Krebs vorliegen und Metastasen klinisch möglicherweise nicht erkennbar sind ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Effekt potenzieller Wirkstoffe auf die Tumorzell-Dormanz und/oder das Erwachen aus der Tumordormanz in Echtzeit und mit hoher Durchsatzkapazität mithilfe des folgenden In-vitro-Assays zu untersuchen, mit dem die Tumordormanz oder der Übergang zum metastatischen Wachstum modelliert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst dormante und/oder metastatische Tumorzellen in einem dreidimensionalen Kultursystem aus Basalmembran-Extrakt (Basement Membrane Extract, BME) kultiviert werden, das an eine 96-Loch-Plattform angepasst ist. In diesem 3D-System treten metastatische Zellen in eine vorübergehende, dormante oder quieszente Phase ein.Im Gegensatz dazu treten Tumorzellen, die im lebenden Organismus inaktiv sind, in einen verlängerten Ruhezustand ein. In dem 3D-Kultursystem können metastatische Zellen anschließend mit in Frage kommenden Wirkstoffen behandelt werden, um ihren Übergang vom Ruhezustand in die Proliferation zu verhindern. Dagegen können inaktive Tumorzellen mit in Frage kommenden Wirkstoffen behandelt werden, die ihren Übergang vom Ruhezustand in die Proliferation auslösen könnten.Das proliferative Verhalten der ruhenden und metastatischen Zellen infolge der Behandlung wird bewertet, indem zum gewünschten Zeitpunkt das Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit hinzugefügt und die Analyse mittels eines ELIZA-Plattenlesegeräts durchgeführt wird. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Wirkung der Behandlung auf die Zellproliferation entweder ruhender oder metastatischer Tumorzellen basierend auf einem Proliferationsassay im 3D-System. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Metastasierung zu beantworten, beispielsweise welche Faktoren und zellulären Mechanismen disseminierte Tumorzellen im Ruhestadium halten, und welche Faktoren und zellulären Mechanismen den Übergang vom Tumorruhezustand zur klinischen Metastasierung auslösen.Qualtrics-Wachstumsfaktor reduzierte BME über Nacht in einem Kühlschrank bei vier Grad Celsius am Tag vor der Durchführung des Proliferationsassays. Wählen Sie dann am Tag des Assays entweder eine ruhende oder metastatische Tumorzellkultur für das Experiment aus. Stellen Sie anschließend eine 96-Well-Platte auf ein Eisbad in einem Becherglas oder in einer Sicherheitswerkbank.Verwenden Sie anschließend einen Dispenser mit einer Spritze, um jede Vertiefung der Platte mit 50 Mikrolitern des aufgetauten eiskalten BME zu beschichten. Achten Sie darauf, dass keine Blasen in den Vertiefungen entstehen. Stellen Sie die mit BME beschichtete 96-Loch-Platte für 30 Minuten in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie während der Inkubation der mit BME beschichteten Platte eine Flasche Trypsin bei 37 Grad Celsius zum Aufwärmen bereit.Entfernen Sie das Medium von den Tumorzellen. Spülen Sie die Kulturschalen mit 10 Milliliter PBS. Anschließend entfernen Sie den PBS und geben zwei Milliliter des vorgewärmten Trypsins zu den Kulturschalen hinzu.Die Platten fünf Minuten lang inkubieren. Fünf Milliliter DMEM mit hohem Glucosespiegel, ergänzt mit 10 % FCS und Antibiotika, in ein 15-Milliliter-Kegelrohr geben. Während dieser Zeit.Nach der Inkubation die abgelösten Zellen in das 15-Milliliter-Röhrchen überführen und die Zellen zählen. Anschließend die gesamte Anzahl der zu kultivierenden Zellen fünf Minuten lang bei 1500 ×g bei Raumtemperatur in einer Zellkulturgefug zentrifugieren. Vorsichtig den Überstand abpipettieren.Lassen Sie etwas Medium zurück, da das Pellet in den meisten Fällen nicht sichtbar ist. Klopfen Sie dann leicht auf den Boden des Röhrchens, um sicherzustellen, dass eine Einzelzell-Suspension erhalten wird. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet mit 100 Mikroliter Assay-Medium pro zwei mal 10 hoch 3 Zellen.Pipettieren Sie die Zellen mehrmals mit einer 5-mL-Pipette, um sicherzustellen, dass eine Einzelzell-Suspension aufrechterhalten wird. Geben Sie 100 µL Zellsuspension pro Vertiefung in die 96-Vertiefungs-BME-beschichtete Platte für die Kontroll-Hintergrund-Devaluationsplatte und zusätzlich 100 µL pro Vertiefung Assay-Medium in nur wenige Vertiefungen der 96-Vertiefungs-BME-beschichteten Platte. Inkubieren Sie anschließend die Platten, aspirieren Sie das alte Medium und versorgen Sie die Zellen alle vier Tage mit frischem Assay-Medium.Um die Zellproliferation zu bewerten, geben Sie 20 Mikroliter der Cell Titer 96 Aqueous One Solution aus einem Zellproliferations-Assay-Kit pro Vertiefung in jede 96-Well-Platte ein, die zum gewünschten experimentellen Zeitpunkt analysiert wird. Inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang. Anschließend erfassen Sie mithilfe eines ELISA-Plattenlesegeräts die Absorption sowohl der experimentellen als auch der Hintergrund-Vertiefungen bei 490 Nanometern zur Vorbereitung der Immunfluoreszenz.Färbung von Signaltransduktionsmolekülen der Zelle und Tumorzellen: Tauen Sie eine BME über Nacht im Kühlschrank bei vier Grad Celsius auf, am Tag vor der Durchführung der Färbung. Am Tag der Färbung stellen Sie ein acht-Kammer-Glasobjektträgersystem auf eine mit Eis gefüllte Schale innerhalb eines Abzugs oder einer Sicherheitswerkbank. Verwenden Sie anschließend eine 200-Mikroliter-Pipette, um jede Kammer des Glasobjektträgersystems mit je 50 Mikrolitern eiskalter BME zu beschichten.Stellen Sie sicher, dass das BME gleichmäßig verteilt ist und sich keine Blasen in den Vertiefungen bilden. Inkubieren Sie die beschichteten Objektträger 20 Minuten lang. Wählen Sie entweder eine ruhende oder eine metastasierende Tumorzelllinie aus.Die Zellen mithilfe von Trypsin wie zuvor beschrieben gewinnen. Anschließend die Gesamtzahl der zu kultivierenden Zellen in einem kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen sammeln. Nun die Zellen abzentrifugieren, das Überstand sorgfältig erneut abpipettieren, wobei etwas Medium zurückbleibt.Um das Pellet aufzuschwemmen, klopfen Sie leicht auf den Boden des 15-Milliliter-Konikalrohrs, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Resuspendieren Sie das Pellet mit 400 Mikroliter Assay-Medium für jeweils fünf mal 10 hoch 3 Zellen. Pipettieren Sie die Zellen mehrmals mit einer 5-Milliliter-Pipette, um sicherzustellen, dass die Einzelzell-Suspension aufrechterhalten wird. Geben Sie 400 Mikroliter Zellsuspension pro Vertiefung in jede der acht mit BME beschichteten Kammern.Danach inkubieren Sie das Objektträgersystem, saugen Sie das alte Medium ab und versorgen Sie die Zellen alle vier Tage zu den gewünschten experimentellen Zeitpunkten mit neuem Testmedium. Saugen Sie die obere Schicht des Mediums ab und geben Sie 200 Mikroliter Fixansatz, ergänzt mit Triton, hinzu; inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Danach saugen Sie den mit Triton versetzten Fixansatz ab und geben 200 Mikroliter alleinigen Fixansatz hinzu; inkubieren Sie weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie das Fixierungsmittel erneut und geben Sie nun 400 Mikroliter PBS zu jedem hinzu. Inkubieren Sie die Platte weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann das PBS und fügen Sie 400 Mikroliter PBS mit 0,05 % zwischen 20 und hinzu und inkubieren Sie weitere 10 Minuten.Auch bei Raumtemperatur. Blockieren Sie nun die fixierten Zellen mit 200 Mikroliter Blockierungslösung. Inkubieren Sie die Zellen anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation saugen Sie die Blockierungslösung ab und geben 200 Mikroliter der in Blockierungslösung verdünnten primären Antikörperlösung zu jeder Probe hinzu.Die Objektträger am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius mit dem primären Antikörper gut inkubieren. Den Antikörper abziehen und anschließend die Vertiefungen dreimal jeweils 15 Minuten lang mit 400 Mikrolitern PBS waschen, wobei die Lösung danach jedes Mal abgezogen wird. Nach dem Abziehen des PBS aus dem letzten Waschschritt 200 Mikroliter eines mit Rodaminrot konjugierten sekundären Antikörpers hinzufügen.Danach das 8-Kammer-Objektträgersystem mit Aluminiumfolie abdecken und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Vertiefungen dreimal wie zuvor mit PBS waschen und nach dem dritten Waschschritt die Objektträger in Beta-Shield-Einbettmedium mit dpi montieren.Trocknen Sie die Objektträger abschließend 40 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Hier ist ein Beispiel einer Proliferationsanalyse der ruhenden D 2.0 R- und metastasierenden D two A one-Tumorzellen in der 3D-Kultur dargestellt. Die D 2.0 R-Zellen verbleiben während des gesamten experimentellen Kulturzeitraums von 14 Tagen in Ruhephase, während die hochmetastasierenden D two A one-Zellen nur vier bis sechs Tage lang ruhend bleiben, danach jedoch während der anfänglichen Ruhephase mit der Proliferation beginnen.Viele Zellen bleiben in der 3D-Kultur solitär, wie hier in einem repräsentativen Bild einer Kultur am Tag vier gezeigt, während andere nicht proliferierende Zellen multizelluläre Steroide bilden. Der Übergang von D zwei A ein-Zellen von einem ruhenden in einen proliferativen Zustand in der 3D-Kultur ist hier in dieser Aufnahme einer Kultur am Tag 12 dargestellt. Er ist mit dramatischen Veränderungen in der Zellmorphologie in dieser Abbildung verbunden.Ein Beispiel für einen Wirkstoff, der verhindert, dass D zwei A eins-Zellen vom ruhenden in einen proliferativen Zustand übergehen, zeigt die Behandlung der D zwei A eins-Zellen mit einem spezifischen Inhibitor gegen die Myosin-leichte-Ketten-Kinase. Halten Sie die D zwei A eins-Zellen in einem ruhenden Zustand, wie in dieser Abbildung dargestellt. Während ihres Übergangs von der Ruhephase (Tag eins bis vier) zur Proliferation tritt eine signifikante Zunahme der Phosphorylierung der Myosin-leichten-Kette in D zwei A eins-Zellen in Rot auf, gefolgt von einer Neuausrichtung der F-Aktin-Filamente, die grüne Aktin-Stressfasern bilden.Tag sieben. Die Blockade der Myosin-Leichtketten-Kinase-Aktivität in D zwei A eins-Zellen hingegen durch SHRA oder durch das Medikament ML sieben hält die D zwei A eins-Zellen in einem ruhenden Zustand und führt zur Hemmung der Myosin-Leichtketten-Phosphorylierung, von F-Actin und der Stressfaser-Organisation, wie hier dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung der Tumordormanz und des Übergangs zum metastatischen Wachstum aufbaut.

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