Name: Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Lernen Sie die Herstellung elektrochemischer DNA-Biosensoren zur reagenzienfreien Detektion von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen in biologischen Matrices wie Blut, Urin und Serum.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (OPP1015402) von der Bill and Melinda Gates Foundation durch die Grand Challenges Explorations-Initiative und durch die NIH durch Zuschüsse GM062958-01 und 2R01EB002046 finanziert. Diese Arbeit wurde zum Teil unter der Schirmherrschaft des US Department of Energy Lawrence Livermore National Laboratory durchgeführt unter Vertrag DE-AC52-07NA27344.

1. Einstellen der Bühne <ol><li> Erwerben Sie die entsprechenden, chemisch modifizierten DNA-Sonde aus einer benutzerdefinierten Oligonukleotidsynthese Unternehmen wie Biosearch Technologies (Novato, CA) oder Midland Certified (Midland, TX). Die Sonde wird während der Synthese durch die Zugabe eines C6 Thiol an seinem 3'-Ende und einem redoxaktiven Methylenblau an seinem 5'-Ende modifiziert. </li><li> Lösen Sie die DNA-Sonde in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 zu einer Konzentration von 200 pM und überprüfen Sie die Konzentration durch Messung der Absorption bei 260 nm mit einem Spektralphotometer. Aufgrund der Methylenblau-Einheit auf der DNA-Sonde sollte die Lösung einen sichtbaren Blaustich. </li><li> Frisch zubereiten 1 mL einer 10 mM Lösung von Tris (2-carboxy) phosphin TCEP in destilliertem, deionisiertem Wasser (DI-Wasser). Nach unseren Erfahrungen bleiben diese TCEP Lösungen für eine Woche frisch, wenn im Dunkeln bei 4 ° C gelagert </li><li> Zur Reduzierung einer Disulfidbindungen, die vorhanden sein in der Sonden-DNA-Lösung könnten, kombinieren 1 ul der Sonde DNA-Stammlösung mit 2 ul der TCEP-Lösung und vorsichtig mischen mit einer Pipette. Inkubieren Sie die Mischung für eine Stunde in einem dunklen, Kühlcontainer. Die ursprünglich blaue Lösung soll klar werden, wie die TCEP reversibel reduziert die Methylenblau. Wenn die Lösung nicht geworden ist klar, wiederholen Sie den Vorgang mit einem frischen TCEP-Lösung oder eventuell bei Raumtemperatur. </li><li> Nach einer Stunde verdünnen reduziert DNA-Sonde Lösung mit 1 ml Puffer, das wird es zu einer Konzentration von 200 nM verdünnt. Später werden Sie inkubieren eine Reihe von Gold Disk-Elektroden in 200 ul Portionen dieser verdünnten Sonde Lösung. </li><li> Frisch vorzubereiten mindestens 2 mL von 2mm Mercaptohexanol in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. </li></ol> 2. Sensor Vorbereitung <ol><li> Kombinieren 0,05 Mikrometer Aluminiumoxid-Pulver mit Wasser an einem schönen Poliertuch. Polnische eine Reihe von Gold Disk-Elektroden (CH Instruments, Austin, TX), indem Sie die Goldoberfläche fest in den feuchten Tuch und bewegten sie in einer Acht-Muster für etwa drei Minuten pro Elektrode. </li><li> Spülen Sie den polierten Elektroden mit DI-Wasser und tauchen sie in Eppendorf-Röhrchen mit der gleichen gefüllt. Ultraschallbad für 5 Minuten, um restliche Aluminiumoxidpulver zu entfernen. </li><li> Platzieren Sie die Elektroden in einem 0,5 M Schwefelsäure-Lösung, bringen Sie sie an einen Potentiostaten zusammen mit einer Platin-Gegenelektrode und Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode, und führen eine Reihe von Voltammogramme zu oxidieren, zu reduzieren, und elektrochemisch reinigen ihre Oberflächen. Im Anschluss an diese führen eine zweite elektrochemische Reinigung in einer Lösung von 0,01 M KCl in 0,1 M Schwefelsäure. Die feinen Details dieser Reinigungsverfahren finden Sie in unserem Nature Protocols Papier 1, und in der Ergänzung, um dieses Video zu finden. </li><li> Vereinbaren Sie einen Satz von 2 mL Eppendorf-Röhrchen in ein Rack und füllen mit je 200 ul der Sonde DNA-Lösung. Die Konzentration der Sonden-DNA in dieser Lösung wird die Dichte, mit der die Sonde DNAs Pack auf der Sensoroberfläche zu definieren. Sensor Performance ist stark abhängig von Sonde Dichte, mit der optimalen Dichte variierend von einem Sensor-Architektur zur nächsten. Die Sonde Konzentration bei diesem Schritt verwendet werden, sollten daher für jede neue Art von Sensor 2 optimiert werden. Für die Sonde Architekturen, die wir bisher untersucht haben, die Sonden-DNA-Konzentrationen beschäftigen wir in diesem Schritt von 15 nm bis 2 um, mit 200 nM, ein typischer Wert. </li><li> Spülen Sie den Gold-Disk-Elektroden mit DI-Wasser, und dann tauchen sie in den entsprechenden Sonden-DNA-Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen für eine Stunde. An diesem Punkt wird die Sonden-DNA auf die Goldelektrode Oberfläche über die Bildung einer Thiol-on-gold selbst Monoschicht befestigen. </li><li> Spülen Sie die Elektroden mit DI-Wasser, tauchen sie in 2mm Mercaptohexanol in ein Eppendorf-Röhrchen und lagern Sie sie an einem dunklen Ort für 3 Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur um eine vollständige Bildung des Selbst Monoschicht zu gewährleisten. Dieser Schritt beinhaltet die Mercaptohexanol als Teil einer gemischten Monoschicht auf die Bildung einer stabilen Monoschicht zu gewährleisten. Um zu verhindern, Verdunstung möchten Sie vielleicht die Elektrode in die Eppendorf-Röhrchen Dichtung mit Parafilm. Sensoren können in dieser Lösung für mehrere Tage bei Bedarf gespeichert werden. </li><li> Wenn Sie bereit sind, den Sensor zu verwenden, spülen Sie ihn mit DI-Wasser und dann lassen Sie sie in einem Puffer für mindestens 10 Minuten. Sensoren an Antikörpernachweis Ziel muss auch in einer 100 nM Lösung des entsprechenden Anerkennung Strang vor dem Gebrauch durch eine extrem schnelle Spülen mit Puffer gefolgt getaucht werden. </li></ol> 3. Sensor Testing, DNA-Erkennung <ol><li> In diesem Protokoll ist ein 17 Nukleotidsonde Strang zu einer Goldelektrode fixiert. Es hat eine Methylenblau-Redox-Reporter am 3'-Ende (Abbildung 1). Wenn die Sonde Molekül mit einem Capture-Strang hybridisiert, nimmt der Strom durch den Sensor-Schaltung. </li><li> Spülen Sie eine frische Sensor mit DI-Wasser und tauchen Sie in eine leereProbe fehlt das Ziel, um das Hintergrundsignal es produziert aufzunehmen. Befestigen Sie den Sensor an der Arbeitselektrode führen eines Potentiostaten. Legen Sie eine Platin-Gegenelektrode und einer Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung. </li><li> Führen Sie einen Rechteck-Messung von 0 bis -0,6 V mit einer Amplitude von 25 mV und einer Schrittweite von 1 mV. Die optimale Rechteck Frequenz wird über die Details der Sonde Architektur 2,3 ab; für die Sonde Architekturen haben wir die optimalen Werte werden typischerweise im Bereich von 60 bis 600 Hz. Sie sollten eine abgerundete Spitze bei etwa -0,35 V, das Redox-Potential von Methylenblau (der Gipfel Potenzial kann leicht verschieben je nach den genauen pH-Wert der Testlösung). Die Höhe von der Grundlinie Strom dieser Peak ist proportional zur Effizienz Elektronen-Transfer zwischen den Methylenblau und der Goldelektrode (Abbildung 2). Speichern Sie diese Hintergrund-Messung. </li><li> Bewegen Sie die Elektroden an einer Lösung, die die Ziel-DNA-Molekül von Interesse enthält, äquilibriert (5 bis 120 min in Abhängigkeit von der Größe, Struktur und Konzentration der target4, 5) und sammeln ein zweites Rechtecksignal voltammagram. Die Höhe des Peaks auf -0,35 V wird von der ersten, Hintergrund Messung ändern. Die Größe dieser Änderung ist es, die Konzentration des Analyten im Zusammenhang. Es ist das wichtigste Output-Daten dieses Sensors (Abbildung 3). </li><li> Messung der relativen Signaländerung, die prozentuale Abnahme oder Zunahme der Signal relativ zum Hintergrund Spitze, ist oft besser reproduzierbar als die Messung der absoluten Veränderung in der aktuellen, da dies korrigiert Variationen in der Oberfläche der Elektrode. Dazu sind die Differenz zwischen dem Spitzenstrom und der Hintergrund Spitzenstrom durch den Hintergrund Spitzenstrom unterteilt. </li></ol> 4. Sensor Regeneration <ol><li> Nachdem Sie Ihre Messungen abgeschlossen sind, bewegen Sie den Sensor in einen Behälter mit DI-Wasser für 30 s gefüllt, oder spritzen sie mit einem stetigen Strom von DI-Wasser für 30 s. Wiederholen Sie diesen noch zwei weitere Male mit frischem deionisiertem Wasser. Hinweis: Einige Analyte sind resistent gegen diesen Ansatz, denn sie versuchen aggressive Spülen in 6 M Guanidin-Hydrochlorid oder 70% Ethanol. </li><li> Setzen Sie den Sensor wieder in eine Lösung, bei der Messungen vorgenommen werden. Innerhalb einer Minute sollte die Peak-Höhe auf den ursprünglichen Wert zurückgekehrt sind. Es ist bemerkenswert, dass diese Sensoren weisen oft eine etwas größere Signaländerung bei ihrem ersten Test-und Regenerationszyklus und sehr konsistente Ergebnisse bei der späteren Zyklen 6. </li></ol> 5. Sensor Testing, Antikörper-Nachweis <ol><li> In diesem Protokoll dient dem Methylenblau und Thiol-modifizierten DNA-Sonde in diesen Sensoren verwendet als "Anker" Strang 7. Es ist direkt an der Goldelektrode angebracht. Dies ist dann mit einer zweiten, "Anerkennung" DNA-Strang, die kovalent an das betreffende Antigen (Abbildung 4) hat hybridisiert. Wir haben viel Glück mit kommerziellen Synthese Häuser wie Biosearch Technologies und Panagene hatte, für die Synthese der benötigten DNA-Antigen-Chimären. Die Hybridisierung wird durch die Übertragung eines vorgefertigten Sensor in ein Eppendorf-Röhrchen mit 100 nM des entsprechenden Anerkennung DNA-Strang in PBS für 1 Stunde durchgeführt. </li><li> Platzieren Sie den Sensor in den entsprechenden Blindprobe. Bringen Sie es zu der Arbeitselektrode führen eines Potentiostaten und legen Sie eine Platin-Gegenelektrode und Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung. </li><li> Führen Rechteck Voltammetrie wie oben beschrieben. Für die besonderen Sonde Architektur haben wir hier das optimale Rechteck-Frequenz beträgt 60 Hz eingesetzt werden. Sie sollten eine abgerundete Spitze um -0,35 siehe V. Save diesem Hintergrund Messung. </li><li> Übertragen Sie die Elektroden an einer Lösung des Zielanalyten, für 5 bis 60 min inkubieren, und sammeln Sie ein zweites Rechteck voltammagram. Wenn das Ziel Antikörper vorhanden Gipfel von -0,35 V sinkt. Die Größe dieser Änderung ist es, die Antikörper-Konzentration zusammen. </li></ol> 6. Sensor Testing, Small Molecule Detection- <ol><li> In diesem Fall ist das Sondenmolekül auf der Sensoroberfläche ein Aptamer, ein DNA-oder RNA-Molekül, das in vitro ausgewählt wurde, um eine spezifische molekulare Analyten, dass seine Struktur ändert (Falten) nach Bindung an ihren Zielanalyten 8,9 bind ( Abbildung 5). Hier beschäftigen wir einen Kokain-Bindung, DNA-Aptamer durch die Stojanovic 10,11 Labor entwickelt. </li><li> Spülen Sie eine frische Sensor mit DI-Wasser und tauchen Sie es in einer Blindprobe fehlt das Ziel, um das Hintergrundsignal es produziert aufzunehmen. Befestigen Sie den Sensor an der Arbeitselektrode führen eines Potentiostaten. Legen Sie eine Platin-Gegenelektrode und einer Silber / Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung. </li><li> Führen Rechteck Voltammetrie wie oben beschrieben. Für die besonderen Sonde Architektur, die wir hier haben, beschäftigt die optimale Rechteck Frequenz ist 200Hz (Aber 60 Hz funktioniert auch). Sie sollten eine abgerundete Spitze um -0,35 siehe V. Save diesem Hintergrund Messung. </li><li> Übertragen Sie die Elektroden an einer Lösung des Zielanalyten, für ~ 5 min inkubieren, und sammeln Sie ein zweites Rechteck voltammagram. Die Höhe des Peaks auf -0,35 V wird sich ändern. Die Größe dieser Änderung ist es, die Konzentration der Analyt zusammen. Wenn Sie nicht erhalten eine Kokain-Probe, Procain, deren Verwendung nicht reguliert ist, kann als Ersatz verwendet werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Wenn verwendet, um DNA zu erkennen mit der ersten Architektur, sollte das Signal von mindestens 60% verringern, wenn äquilibriert bei 200 nM Ziel. Nach drei kurzen Spülen in deionisiertem Wasser, sollte das Signal sehr nahe return (innerhalb 0,1-5%) auf den ursprünglichen Wert. Antikörpernachweis Sensoren sollten einer Abnahme des Signals um 40 bis 80%. Aptamer-basierte Sensoren für den Nachweis von Kokain zeigen ein Signal von bis zu 200% in Abhängigkeit von der Frequenz und Flächendeckung in denen sie tätig sind. Für die Kokain-Sensor ist eine geringe Flächendeckung besten 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Erkennung von DNA mit einem elektrochemischen DNA-Biosensor. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Screenshot zeigt das Signal von einem E-DNA-Biosensor im Rechteck Voltammetrie produziert. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Screenshot zeigt die Signale von einem E-DNA-Biosensor im Rechteck Voltammetrie produziert, vor und nach der Hybridisierung mit einem Analyten. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Nachweis von Antikörpern mit einem Gerüst Biosensor. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Erkennung von Kokain oder Procain mit einem elektrochemischen Aptamer Biosensors. <table border="1"><tbody><tr><td> Benutzerdefinierte Oligo </td><td> Reihenfolge </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Linear Probe DNA (LP17) </td><td> 5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 ' </td><td> HPLC gereinigt, kann mit SS bestellt werden </td></tr><tr><td> Zielanalyten DNA </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Unverändert </td></tr><tr><td> Recognition Strand </td><td> 5'-Antigen-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 ' </td><td></td></tr><tr><td> Scaffold Anchor </td><td> 5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7-MB </td><td> HPLC gereinigt, kann mit SS bestellt werden </td></tr><tr><td> A4 Cocaine Aptamer </td><td> 5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 ' </td><td> HPLC gereinigt, kann mit SS bestellt werden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Sonde und Target DNA-Sequenzen.

<ol><li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+electrode-immobilized%2C+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li>
<li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li>
<li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Probe+Length%2C+Probe+Geometry%2C+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li>
<li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-Based+Electrochemical+Biosensors%3A+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li>
<li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-Specific%2C+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood%2C+Soil%2C+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless%2C+Reusable+E-DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li>
<li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein%3FSmall+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li>
<li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electronic%2C+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid%2C+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li>
<li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li>
<li>Stojanovic, M. N., Prada, P. de, Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li>
<li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Reusable%2C+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li>
<li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Specificity%2C+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li>
<li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li>
<li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless%2C+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li>
<li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li>
<li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous%2C+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic%2C+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li>
</ol>

Ein wichtiger Hinweis ist, dass keines der oben beschriebenen Experimente ordnungsgemäß funktionieren, wenn die Elektroden richtig gereinigt worden sein. Hier ist eine Anleitung für unsere elektrochemische Reinigung. Bei der Arbeit mit CH Instruments Potentiostaten, führen wir diese Reinigungsschritte mit einem Satz von drei Makro-Programmen. Phase Zero (E-clean O) Tauchen Sie die Elektroden in 0,5 MH 2 SO 4 und verbinden sie mit der Arbeit Elektroden eines Potentiostaten. Auch legen und tauchen ein Ag / AgCl Referenz-und Platin-Gegenelektrode. Beginnen Sie mit einer Oxidationsstufe (2 V für 5 s) und dann ein Reduktionsschritt (0,35 V für 10 s). Phase One (E-clean 1) Initiieren Oxidation und Reduktion Scans unter den gleichen sauren Bedingungen (0,5 M H 2 SO 4) 0,35 bis 1,5 V (20 Scans mit einer Abtastrate von 4 V / s und eine Probe im Abstand von 0,01 V, die von vier Scans mit einer Abtastrate gefolgt von 0,1 V / s und einem Abtastintervall von 0,01 V). Phase Zwei (E-clean 2) Führt eine Reihe von elektrochemischen Oxidation und Reduktion Scans unter sauren Bedingungen (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4) für vier verschiedene Möglichkeiten reicht (alle für 10 Segmente mit einer Abtastrate von 0,1 V s 1 und eine Probe im Abstand von 0,01 V durchgeführt ): (i) Potentialbereich von 0,2 bis 0,75 V, (ii) Potentialbereich von 0,2 bis 1,0 V; (iii) Potentialbereich von 0,2 bis 1,25 V, (iv) Potentialbereich von 0,2 bis 1,5 V. Viele Arten von Gold-Elektroden können verwendet werden, um diese Experimente durchzuführen. Neben Gold Disk-Elektroden, wie sie hier verwendeten, hatten wir Erfolg mit mikrostrukturierten Goldoberflächen, Golddraht und Gold auf Leiterplatten. Zusammen mit den Sensoren in diesem Papier beschrieben, haben viele andere elektrochemische DNA-Biosensor-Architekturen berichtet worden. Dazu gehören Sensoren mit Pseudoknoten 12, Triple-Strang 13, Sandwich-14, Super-Sandwich 15, oder Triplex-16 Architektur. In Zukunft erwarten wir, dass diese Sensoren in point of care medizinischen Diagnostik verwendet werden. Sie wurden erfolgreich in mehreren mikrofluidischen Bauteilen 17,18 integriert und bieten viele Vorteile gegenüber optischen Analyt-Detection-Systeme. Insbesondere können diese Sensoren in trüben Funktion, optisch dichten und hoch auto-fluoreszierende Proben.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Gold Disk-Elektroden </td><td> CH Instruments </td><td> CHI101 </td><td> Kann wieder verwendet werden </td></tr><tr><td> Synthetische DNA-Sonde </td><td> Biosearch Technologies </td><td> Brauch </td><td></td></tr><tr><td> Synthetische Ziel-DNA </td><td> Sigma Genosys </td><td> Brauch </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 725226-1G </td><td> An einem kühlen dunklen Ort </td></tr><tr><td> Platinelektrode </td><td> BASI </td><td> MW-1032 </td><td> Kann wieder verwendet werden </td></tr><tr><td> Ag / AgCl Referenz </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td><td> Kann wieder verwendet werden </td></tr><tr><td> Poliertuch </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Alumina polnischen </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Instruments 605A </td><td> CH Instruments </td><td> 605A </td><td> Verwenden Sie Potentiostaten </td></tr><tr><td> Newborn Calf Serum </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Eingefroren gelagert </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> Verwenden Sie keine UV-Vis </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Eingefroren gelagert </td></tr><tr><td> Kokain </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5776 </td><td> DEA Lizenz erforderlich </td></tr><tr><td> Procain </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Ersatz für Kokain </td></tr><tr><td> Anti-Flag Antikörper </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von elektrochemischen dna biosensoren für die reagenzienfreier nachweis von nukleinsäuren, proteinen und kleinen molekülen

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Als Medizin derzeit praktiziert wird, schicken Ärzte Proben an ein zentrales Labor für die Prüfung und muss daher Stunden oder Tage warten, um die Ergebnisse zu erhalten. Viele Patienten würden besser durch schnelle, Nachttisch-Tests serviert werden. Zu diesem Zweck unser Labor und andere haben ein vielseitiges, Reagenzienfreier Biosensor-Plattform, die quantitative, Reagenzienfreier, elektrochemische Detektion von Nukleinsäuren (DNA, RNA), Proteine ​​(einschließlich Antikörper) und kleinen Molekülen Analyten direkt in unverarbeiteten klinischen und Umweltproben unterstützt entwickelt. In diesem Video zeigen wir die Herstellung und Verwendung von mehreren Biosensoren in diesem &quot;E-DNA&quot;-Klasse. Insbesondere fertigen wir und zeigen, Sensoren für die Detektion einer Ziel-DNA-Sequenz in einer Polymerase-Kettenreaktion Mischung, eine HIV-spezifische Antikörper und die Droge Kokain. Die Vorbereitung Verfahren erfordert nur drei Stunden von Hands-on-Aufwand durch eine Inkubation über Nacht folgte, und ihre Verwendung erfordert nur wenige Minuten.

&quot;E-DNA&quot;-Sensoren, Reagenzienfreier haben elektrochemische Biosensoren, die gute Leistungen, auch wenn direkt in Blut und anderen komplexen Matrices in Frage gestellt, um den Nachweis einer Vielzahl von Nukleinsäure-, Protein-und Small Molecule Analyten angepasst. Hier präsentieren wir ein allgemeines Verfahren für die Herstellung und Verwendung solcher Sensoren.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

In der derzeitigen medizinischen Praxis senden Ärzte Proben zur Untersuchung an ein Zentrallabor und müssen daher Stunden oder Tage auf den Erhalt der Ergebnisse warten. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, elektrochemische DNA-Sensoren herzustellen und einzusetzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Sonden-DNA reduziert und anschließend die Gold-Elektroden gereinigt werden, auf denen die Sensoren aufgebaut sind. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, eine auf Thiol auf Gold basierende selbstassemblierte Monoschicht, die die Sonden-DNA enthält, auf die Gold-Elektroden aufzubringen.Danach wird die Oberfläche der Goldelektrode mit Mercaptoethanol aufgefüllt. Um sicherzustellen, dass eine vollständige, gut ausgebildete Monoschicht entsteht, werden im letzten Schritt des Verfahrens die Sensoren mit Proben wie Puffer, Urin, Serum oder Blut verwendet. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Analytkonzentrationen durch Änderungen im Spitzenstrom von Quadratwellen- oder Wechselstromvoltammetrie zeigen.Diese Technik hat weitreichende Implikationen in der molekularen Diagnostik, da diese Sensoren viele verschiedene Biomarker und Wirkstoffmoleküle direkt in Urin oder Serum nachweisen können. Herr Aaron Rowe, ein Doktorand in meiner Forschungsgruppe, wird das Verfahren demonstrieren. Er wird von zwei Postdoktoranden unterstützt, die mit uns zusammenarbeiten, Dr. Ryan White und Dr. Andrew Bonham.Um zu beginnen, kaufen Sie die entsprechende Sonde, DNA, von einem Unternehmen für kundenspezifische Oligonukleotidsynthese; die Sonde wird während der Synthese durch Anlagerung eines sechskettigen Thiolrests an ihrem 5'-Ende und eines redoxaktiven Methylenblaus an ihrem 3'-Ende modifiziert. Lösen Sie die Sonden-DNA so auf, dass eine Lösung mit bläulicher Färbung entsteht, die auf das Methylenblau-Molekül zurückzuführen ist. Überprüfen Sie die Konzentration, indem Sie die Absorption bei 260 Nanometern mithilfe eines Spektrophotometers messen. Reduzieren Sie eventuell vorhandene Disulfidbindungen in der Sonden-DNA-Lösung, indem Sie ein Mikroliter der Sonden-DNA-Stammlösung mit zwei Mikrolitern frisch zubereiteter TEP-Lösung vermischen.Mischen Sie die resultierende Lösung vorsichtig mit einer Pipette. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang in einem dunklen, gekühlten Behälter. Während der Inkubation sollte die blaue Lösung klar werden, da das TEP das Methylenblau reversibel reduziert.Als Nächstes verdünnen Sie die reduzierte DNA-Sondenlösung mit PBS-Puffer auf die gewünschte Konzentration, die üblicherweise zwischen 25 und 1000 liegt. Die Vorbereitung eines nanomolaren Sensors beginnt damit, 0,05 Mikrometer Illumina-Pulver mit Wasser auf einem feinen Poliertuch zu vermischen. Verwenden Sie dieses Tuch, um eine Reihe von Goldscheibenelektroden zu polieren, indem Sie die Goldoberfläche fest in das feuchte Tuch drücken und sie etwa drei Minuten pro Elektrode in einer Achtform bewegen.Spülen Sie die polierten Elektroden nach dem Spülvorgang mit entionisiertem Wasser. Tauchen Sie sie in EOR-Röhrchen, die mit entionisiertem Wasser gefüllt sind. Anschließend werden die Elektroden fünf Minuten lang ultraschallbehandelt, um eventuell verbliebene Illumina-Pulverreste zu entfernen.Nach der Beschallung bringen Sie die Elektroden in eine 0,5-molare Schwefelsäurelösung ein. Dann führen Sie eine Platinkounter-Elektrode und eine Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung ein und schließen sie an ein Potentiostat an. Führen Sie anschließend eine Reihe von Voltammogrammen durch, um die Oberflächen der Elektroden elektrochemisch zu reinigen.Die Einzelheiten dieser Verfahren sind im schriftlichen Zusatz zu diesem Video und in einem von dieser Arbeitsgruppe zuvor in Nature Protocols veröffentlichten Artikel enthalten. Danach eine zweite elektrochemische Reinigung in einer Lösung aus KCl in Schwefelsäure gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren durchführen. Anschließend eine Reihe von zwei Milliliter fassenden Eppendorf-Röhrchen in einem Reagenzständer anordnen und jedes mit 200 Mikrolitern der Sonden-DNA-Lösung füllen.Die Konzentration der Sonde, DNA in dieser Lösung, bestimmt die Dichte, mit der die Sonden-DNA auf der Sensoroberfläche gepackt ist, und sollte für jeden neuen Sensortyp optimiert werden. Spülen Sie die Goldscheibenelektroden mit entionisiertem Wasser. Tauchen Sie sie anschließend eine Stunde lang in einem Eppendorf-Röhrchen in die entsprechende Sonden-DNA-Lösung ein.An diesem Punkt bindet die Sonden-DNA über die Bildung einer Thiol-auf-Gold-selbstorganisierten Monoschicht an die Oberfläche der Goldelektrode. Nach erneutem Spülen der Elektroden mit entionisiertem Wasser tauchen Sie diese in ein Eppendorf-Röhrchen mit zwei Millimolar Mercaptoethanol. Dadurch wird die Oberfläche aufgefüllt, wodurch eine vollständige und stabile selbstorganisierte Monoschicht gewährleistet ist.Um Verdunstung zu verhindern, verschließen Sie die Elektroden mit Paraform in der Einor-Röhre. Lagern Sie die eingetauchten Elektroden drei Stunden bis über Nacht an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur, um die vollständige Bildung der selbstassemblierten Monoschicht sicherzustellen. Zum Vorbereiten des Sensors für die Verwendung nach der Inkubation spülen Sie den Sensor mit entionisiertem Wasser ab und legen ihn anschließend mindestens 10 Minuten in Pufferlösung ein.Der Nachweis von DNA mit Sensoren wird anhand eines 17 Nukleotide langen Sondenstrangs demonstriert, der über eine Thiolgruppe an seinem 5'-Ende an eine Goldelektrode gebunden ist; die Sonde enthält einen methylenblauen Redox-Reporter an ihrem 3'-Ende. Wenn das Sondenmolekül mit einem Capture-Strang hybridisiert, nimmt der elektrochemische Strom, der vom Sensor erzeugt wird, ab. Zunächst spülen Sie einen frischen Sensor mit entionisiertem Wasser und tauchen ihn in eine Blindprobe ein.Um das Hintergrundsignal aufzuzeichnen, führen Sie eine Quadratwellenmessung von null auf minus 0,6 Volt mit einer Amplitude von 25 Millivolt und einer Schrittspannung von einem Millivolt durch. Die optimale Quadratwellenfrequenz hängt von den Details der Sondenarchitektur ab. Bei etwa minus 0,25 Volt sollte ein abgerundeter Peak erscheinen, dem Redoxpotential von Methylenblau entsprechend.Die Höhe des Grundstroms bis zu diesem Peak ist proportional zur Effizienz des Elektronentransfers zwischen Methylenblau und der Goldelektrode. Speichern Sie diese Hintergrundmessung. Danach bringen Sie die Elektroden in eine Lösung, die das gewünschte Ziel-DNA-Molekül enthält, und lassen Sie sie equilibrieren.Alternativ kann die Ziel-DNA der Lösung hinzugefügt werden, in der die Sensoren eingetaucht sind. Nehmen Sie ein zweites Quadratwellenvoltammogramm auf. Die Höhe des Peaks bei minus 0,25 Volt wird sich im Vergleich zur anfänglichen Hintergrundmessung verändern.Die Größe dieser Änderung hängt mit der Konzentration des Analyten zusammen. Sie stellt die primäre Ausgabedaten des Sensors dar. Berechnen Sie nach der Messung die relative Signaländerung.Dieser Prozentsatz ist häufig besser reproduzierbar als die Messung der absoluten Stromänderung, da er elektrodenübergreifende Unterschiede in der Oberfläche korrigiert. Nach Abschluss des Verfahrens kann der Sensor wie in der begleitenden schriftlichen Anleitung zur Antikörperdetekttion beschrieben regeneriert werden. Bei Verwendung der Sensoren dient methylenblau- und thiolmodifizierter DNA als Ankerstrang und wird direkt an die Goldelektrode gebunden.Dies wird anschließend mit einem zweiten Erkennungsstrang, einem DNA-Strang, der kovalent mit dem entsprechenden Antigen konjugiert wurde, hybridisiert. Darauf folgt die Zugabe und Inkubation mit einem spezifischen Antikörperziel. Führen Sie den Hybridisierungsschritt durch, indem Sie einen vorgefertigten Sensor in ein Eppendorf-Röhrchen mit 100 Nanomolar der entsprechenden Erkennung überführen.DNA-Strang in PBS den Sensor eine Stunde lang inkubieren. Danach den Sensor in PBS-Puffer tauchen, um nicht hybridisierte Sonden zu entfernen, bevor er in die entsprechende blank-Lösung überführt wird. Als Nächstes den Sensor in die relevante Blank-Lösung bringen und eine Platinkounter- sowie eine Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode in die Lösung eintauchen.Befestigen Sie die Elektroden am Potentiostaten. Führen Sie die Voltammetrie mit Rechteckwellen wie zuvor beschrieben durch; die optimale Rechteckwellenfrequenz für die spezielle Sondenarchitektur, die in diesem Beispiel verwendet wird, beträgt 60 Hertz. Bei etwa minus 0,25 Volt sollte ein abgerundeter Peak erscheinen.Speichern Sie diese Hintergrundmessung. Überführen Sie die Elektroden in eine Lösung, die das Zielanalyt enthalten, nach einer Inkubation von fünf bis 60 Minuten, und erfassen Sie eine zweite Quadratwellenvoltammetrie. Wenn der Zielantikörper vorhanden ist, wird das Signal bei minus 0,25 Volt abnehmen.Die Größe dieser Veränderung hängt mit der Antikörperkonzentration zusammen. Um den Nachweis von kleinen Molekülen zu demonstrieren, ist die Sonden-DNA auf der Sensoroberfläche ein Aptamer. Ein Aptamer ist ein DNA- oder RNA-Molekül, das in vitro selektiert wurde, um einen bestimmten molekularen Analyten zu binden.Aptamere können oft so umgestaltet werden, dass sich ihre Struktur verändert. Bei einer solchen Bindung ändert das hier verwendete Aptima seine Konformation, nachdem es an das Rauschgift Kokain gebunden hat.Als Erstes einen neuen Sensor mit entionisiertem Wasser spülen und in eine Blindprobe ohne das Zielanalyt einbringen, um das erzeugte Hintergrundsignal aufzuzeichnen. Anschließend eine Platinschlechtelektrode und eine Silber-Silberchlorid-Bezugselektrode in die Lösung geben. Die Elektroden mit den Leitungen eines Potentiostaten verbinden und eine Quadratwellen- oder Wechselstrom-Voltammetrie durchführen.Wie bereits beschrieben, beträgt die optimale Rechteckwellenfrequenz für die hier verwendete Sondenarchitektur 60 Hertz. Erneut sollte ein abgerundeter Peak bei etwa minus 0,25 Volt erscheinen und als Hintergrundmessung gespeichert werden. Danach überführen Sie die Elektroden in eine Lösung, die den Zielanalyten enthält.Nach einer 32. Inkubation eine zweite Wechselstromvoltammetrie oder Alternating-Current-Voltammetrie durchführen. Die Höhe des Peaks bei minus 0,25 Volt wird sich verändern. Die Größe dieser Veränderung steht in Beziehung zur Konzentration des Zielanalyten.Wenn elektrochemische DNA-Biosensoren verwendet werden, um DNA mit der hier beschriebenen Sondenarchitektur nachzuweisen, sollte das Signal um mindestens 60 % abnehmen. Nach dem Equilibrieren mit einem 200 Nanomolar-Zielmolekül, gefolgt von drei kurzen Spülgängen mit entionisiertem Wasser, sollte das Signal auf 0,1 bis 5 % seines ursprünglichen Werts zurückkehren. Ebenso sollte das Signal bei Verwendung der hier beschriebenen Sensoren zum Nachweis von Antikörpern um 40 bis 80 % abnehmen, sobald Antikörper gebunden sind. Umgekehrt zeigen auf Aptameren basierende Sensoren zum Nachweis von Kokain eine Signalzunahme um bis zu 200 % nach Bindung kleiner Moleküle.Die Größe dieser Änderung hängt von der elektrochemischen Abtastfrequenz und der Oberflächenbedeckung der Sensoren ab. Für den Kokain-Sensor ist eine relativ geringe Oberflächenbedeckung am besten. Sobald die Herstellung und Anwendung dieser Sensoren beherrscht ist, kann dies an einem einzigen Tag durchgeführt werden.Es ist wichtig, bei der Durchführung dieses Verfahrens daran zu denken, dass Parameter wie die Pulsfrequenz oder die Probendichte auf der Elektrodenoberfläche die Sensorenleistung stark beeinflussen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, wissen Sie, wie man elektrochemische DNA-Biosensoren, Aptamer-Biosensoren und Gerüst-Biosensoren herstellt, und Sie kennen die Anwendung dieser Sensoren für eine Vielzahl grundlegender Messungen. Die einzige nennenswerte Gefährdung in diesem Protokoll besteht in der Verwendung von Schwefelsäure, die ätzend ist; daher sind Augenschutz und Handschuhe zwingend erforderlich.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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