Name: Biochemische Measurement of Neonatal Hypoxie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Erfahren Sie die biochemische Messung von Hypoxie bei Neugeborenen mittels HPLC und GC/MS. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Purinen, Allantoin, MDA und Xanthinoxidase-Aktivität im Plasma zur Diagnose neonataler Hypoxie-Ischämie.

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<ol><li>Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapartum+hypoxia%3A+the+association+between+neurological+assessment+of+damage+and+abnormal+excretion+of+ATP+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites.</a> J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).</li>
<li>Shalak, L., Perlman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic-ischemic+brain+injury+in+the+term+infant-current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts.</a> Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).</li>
<li>Webster, W. S., Abela, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypoxia+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">The effect of hypoxia in development.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).</li>
<li>Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+xanthine+dehydrogenase+to+oxidase+in+ischemic+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues.</a> J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).</li>
<li>Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+action+of+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inorg+Biochem%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase.</a> J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).</li>
<li>Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+xanthine+oxidoreductase%3A+the+enzyme+is+grossly+deficient+in+molybdenum+and+substantially+deficient+in+iron-sulphur+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres.</a> Biochem J. 388, 501-508 (2005).</li>
<li>Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allantoin+in+human+plasma%2C+serum%2C+and+nasal-lining+fluids+as+a+biomarker+of+oxidative+stress%3A+avoiding+artifacts+and+establishing+real+in+vivo+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).</li>
<li>Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+and+allantoin+levels+in+Down+syndrome%3A+antioxidant+and+oxidative+stress+mechanisms%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?</a> Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).</li>
<li>Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+thiobarbituric+acid-reacting+substances+as+potential+biomarkers+of+intrauterine+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pediatr+Adolesc+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia.</a> Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).</li>
<li>Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+hydroperoxide+and+advanced+oxidation+protein+products+in+preterm+hypoxic+babies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies.</a> Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).</li>
<li>Berne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+nucleotides+in+hypoxia%3A+possible+role+in+regulation+of+coronary+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow.</a> Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).</li>
<li>Harkness, R. A., Lund, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+hypoxanthine%2C+xanthine%2C+uridine+and+inosine%3A+high+concentrations+of+the+ATP+metabolite%2C+hypoxanthine%2C+after+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia.</a> J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).</li>
<li>Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+markers+of+neonatal+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Health%22%5BJournal%5D)">Biochemical markers of neonatal hypoxia.</a> Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).</li>
<li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection%3A+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li>
<li>Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methyl+malondialdehyde+as+internal+standard+for+malondialdehyde+detection+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis.</a> Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-ethoxyacrolein+contamination+increases+malondialdehyde+inhibition+of+milk+xanthine+oxidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity.</a> Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry%3A+what+is+needed+for+an+accurate+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li>
<li>Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+human+plasma+xanthine+oxidase+activity+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Appl%22%5BJournal%5D)">Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography.</a> J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology</a>. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).</li>
<li>Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+15N+isotopic+enrichment+and+concentrations+of+allantoin+and+uric+acid+in+urine+by+gas+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier beschriebenen Methoden erlauben die Beurteilung des Neugeborenen-Hypoxie Ischämie. Dieses Protokoll verbindet die Messungen von Markern von Energie (ATP) Deprivation, oxidativer Stress, oxidative Schäden und Enzymaktivität zu einer umfassenden biochemischen Bild von der Gegenwart oder auch der Grad der hypoxischen Ischämie zu gewinnen. Trotz der Nützlichkeit dieser Methode gibt es potenzielle Einschränkungen. Erstens dauert es etwa 1-2 ml Blut, um genügend Plasma zu sammeln, um alle Tests auszuführen. Dies wird...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> 6ml K3E EDTA K3 Rohr </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> 5702R-Zentrifuge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05413319 </td><td> Mit 13 und 16 mm Adapter </td></tr><tr><td> 1.5ml Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Amino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td> Varian Cary 100 Spektralphotometer </td><td> Agilant Technologies </td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td> Savant SpeedVac </td><td> Thermo Scientific </td><td> SC210A-115 </td><td></td></tr><tr><td> Micron Zentrifugalfilter Gerät </td><td> Fisher Scientific </td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Column </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Supelguard Patrone und Halter </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Waters </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GCMS Vial </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Allantoin-5 -13 C; 1 -15 N </td><td> EUR Isotopes </td><td> M-2307 </td><td> Lot # L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td> Pyridin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E GC / MSD </td><td> Agilent Technologies </td><td> G7021A </td><td> Part # für 5975E GC / MS </td></tr><tr><td> 3-Ethoxymethacrolein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Dichlormethan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td> Benzol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td> Diisopropylether </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td> Phenylhydrazin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

biochemische measurement of neonatal hypoxie

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Neonatal Hypoxie Ischämie durch unzureichende Durchblutung eines Gewebes oder eines systemischen Mangel an Sauerstoff aus. Diese Bedingung gilt als Ursache / verschärfen gut dokumentiert neonatalen Erkrankungen einschließlich neurologische Beeinträchtigung 1-3. Verminderte Adenosintriphosphat Produktion entsteht durch einen Mangel an oxidative Phosphorylierung. Zum Ausgleich für diese Energie entzogen Zustand Molekülen mit hoher Energie Phosphatbindungen abgebaut werden 2. Dies führt zu erhöhten Werten von Adenosin, die später abgebaut zu Inosin, Hypoxanthin, Xanthin ist, und schließlich zu Harnsäure. Die beiden letzten Schritte in diesem Abbauprozess durch Xanthin-Oxidoreduktase durchgeführt. Dieses Enzym existiert in Form von Xanthin-Dehydrogenase unter normoxischen Bedingungen ist aber auf Xanthinoxidase (XO) unter Hypoxie-Reperfusion Umständen 4, 5 umgewandelt. Im Gegensatz zu Xanthin-Dehydrogenase, generiert XO Wasserstoffperoxid als Nebenprodukt der Purin-Abbau 4, 6. Das Wasserstoffperoxid in Kombination mit anderen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) bei Hypoxie produziert, oxidiert Harnsäure zu Allantoin Form und reagiert mit Lipidmembranen zu Malondialdehyd (MDA) 7-9 zu generieren. Die meisten Säugetiere, Menschen befreit, besitzen das Enzym Uricase, die wandelt Harnsäure zu Allantoin. Beim Menschen kann jedoch nur durch Allantoin ROS-vermittelte Oxidation von Harnsäure gebildet werden. Aus diesem Grund ist Allantoin als Marker für oxidativen Stress in den Menschen, aber nicht in der Säugetiere, die Uricase haben. Wir beschreiben Methoden unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS) auf biochemischer Marker des Neugeborenen Hypoxie Ischämie zu messen. Menschliches Blut für die meisten Tests verwendet wird. Tierisches Blut, kann auch verwendet werden bei gleichzeitiger Anerkennung des Potenzials für Uricase-generated Allantoin werden. Purin-Metaboliten wurden die Hypoxie so früh wie 1963 und die Zuverlässigkeit von Hypoxanthin, Xanthin verbunden und Harnsäure als biochemische Indikatoren der neonatalen Hypoxie wurde von mehreren Forschern 10-13 validiert. Die HPLC-Methode zur Quantifizierung von Purin-Verbindungen eingesetzt ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar. Die GC / MS-Methode zur Quantifizierung von Allantoin, ein relativ neuer Marker für oxidativen Stress verwendet, wurde von Gruber et al 7 angepasst. Diese Methode vermeidet bestimmte Artefakte und erfordert einen geringen Volumina der Probe. Methoden zur Synthese von MMDA verwendet wurden an anderer Stelle 14, beschrieben 15. GC / MS Quantifizierung von MDA wurde von Paroni et al angepasst. und Cighetti et al. 16, 17. Xanthinoxidase-Aktivität wurde durch HPLC durch Quantifizierung der Umwandlung von Pterin zu Isoxanthopterin 18 gemessen. Dieser Ansatz erwies sich als ausreichend empfindlich und reproduzierbar.

Eine Methode ist beschrieben, biochemischer Marker des Neugeborenen Hypoxie-Ischämie zu messen. Der Ansatz nutzt Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC / MS).

Biochemische Measurement of Neonatal Hypoxie

Neonatale Hypoxie-Ischämie ist durch eine unzureichende Durchblutung eines Gewebes oder einen systemischen Sauerstoffmangel gekennzeichnet. Es wird angenommen, dass dieser Zustand zu ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, biochemische Marker einer neonatalen hypoxisch-ischämischen Schädigung zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Blutproben von Säuglingen entnommen werden, um das Plasma zu isolieren. Anschließend wird ein Teil des Plasmas filtriert, mit einem internen Standard versetzt und auf die Konzentrationen von Hypoxanthin, Santin und Harnsäure mittels HPLC zwei analysiert.Anschließend werden weitere Plasmaaliquote unterschiedlich verarbeitet und getrennt analysiert. Für die Bestimmung der Allantoinkonzentration und der MDA-Spiegel mittels GCMS besteht der letzte Schritt des Verfahrens darin, nach Beendigung der Reaktion einen Teil des Plasmas mit einem Substrat zu kombinieren, um die enzymatische Reaktion einzuleiten. Die Aktivität der Xanthe-Oxidase kann an einem HPLC-Gerät mit Fluoreszenzdetektor bestimmt werden.Letztendlich erh&auml;lt man Ergebnisse, die Chromatogramme der Peakfl&auml;chen zeigen, die &uuml;ber Standardkurven in molare Konzentrationen der gew&uuml;nschten biochemischen Marker oder der Enzymaktivit&auml;t umgewandelt werden k&ouml;nnen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zur Therapie und Diagnose der neonatalen Hypoxie-Isch&auml;mie, da diese Methode Messungen von Markern f&uuml;r Energiemangel, oxidativen Stress, oxidative Sch&auml;den und Enzymaktivit&auml;t kombiniert, um ein umfassendes biochemisches Bild des Vorhandenseins und sogar des Ausma&szlig;es einer hypoxisch-isch&auml;mischen Ver&auml;nderung vor Beginn dieses Verfahrens zu erzeugen. Eine menschliche Blutprobe wird unmittelbar nach der Geburt von einem Neugeborenen innerhalb von weniger als f&uuml;nf Minuten in einer sechs Milliliter fassenden EDTA-R&ouml;hre entnommen.Nach der Sammlung die Probe bei vier Grad Celsius und 1.500 × g für 10 Minuten zentrifugieren. Das Plasma, das sich im Überstand befindet, in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 30 Minuten lang zentrifugieren. Den Überstand entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, dass die Proben nicht mit roten Blutkörperchen kontaminiert werden.Überführen Sie die Proben in separate Mikrozentrifugenröhrchen für die Analyse von Purin-Lanin, MDA und Xanth-Oxidase für jede PLC-Messung von Purinen. Übertragen Sie 200 Mikroliter des Plasmas auf ein zentrifugales Filtersystem. Zentrifugieren Sie das Plasma bei vier Grad Celsius und 14.000 × g für 1,5 Stunden.Entfernen Sie das Filtrat und überführen Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das zwei Amino-Purin enthält. Achten Sie darauf, das Volumen des Filtrats zu dokumentieren, das dem Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei AP zugegeben wurde, um die Konzentration genau bestimmen zu können. Vortexen Sie das Röhrchen 10 bis 20 Sekunden lang.Analysieren Sie die Proben mittels HPLC gemäß dem schriftlichen Protokoll, wobei jeweils drei Injektionen von 50 Mikroliter pro Probe verwendet werden. Bestimmen Sie anhand der resultierenden Chromatogramme die Konzentration der Purine in der Probe. Quantifizieren Sie Hypoxanthin, Xanthin und Harnsäure durch Ermittlung der Peakflächen bei den entsprechenden Retentionszeiten und Wellenlängen.Anschließend die Peakfläche von zwei AP quantifizieren. Mithilfe dieser Informationen können die Flächenverhältnisse von Hyperxanthin und Harnsäure zu zwei AP berechnet werden. Danach die Verhältnisse anhand von Standardkurven in Mikromolar-Konzentrationen umrechnen. Zur Messung von Lanin 50 Mikroliter des internen Standards und 100 Mikroliter Acetonitril zu 50 Mikrolitern Plasma hinzufügen.Nach dem Wirbeln der Mischung für 10 bis 20 Sekunden. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang nach der Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein GCM S-Gefäß.Trocknen Sie die Flüssigkeit unter Stickstoffgas. Sobald die Flüssigkeit trocken ist, geben Sie 25 µL Derivatisierungsreagenz M-T-B-S-T-F-A und 25 µL Pyridin hinzu. Verschließen Sie das Gefäß und inkubieren Sie es zwei Stunden bei 50 °C.Überführen Sie die Probe anschließend in ein anderes GCMS-Gefäß mit einem 300-Mikroliter-Insert. Analysieren Sie die Proben mittels Autosampler am GCMS. Führen Sie die Trennung der Verbindungen mit Helium als Trägergas bei einer Flussrate von 1,5 Milliliter pro Minute durch.Um die GC-MS-Analyse zu beginnen, geben Sie die Parameter für den Lauf ein. Stellen Sie die anfängliche Säulentemperatur auf 100 Grad Celsius ein und halten Sie diese Temperatur zwei Minuten lang konstant, bevor Sie sie mit einer Rate von 10 Grad Celsius pro Minute auf 180 Grad Celsius erhöhen. Halten Sie die Temperatur vier Minuten lang konstant, dann erhöhen Sie sie mit einer Rate von 20 Grad Celsius pro Minute auf 260 Grad Celsius.Halten Sie diese Temperatur bis zum Ende des Laufs aufrecht. Verwenden Sie den Autosampler, um ein Mikroliter des DERIVATISIERTEN Produkts im Split-Modus zu injizieren, und führen Sie den Lauf zwischen den einzelnen Probenläufen durch. Lassen Sie den Autosampler die Säule mit zwei Injektionen von ein-zu-eins M-T-B-S-T-F-A-Pyridin reinigen.Um ein LAN-Toin zu quantifizieren, wählen Sie den Ionenüberwachungsmodus und überwachen das Ion mit dem Massenladungsverhältnis 398 für Atlanto in und das Massenladungsverhältnis 400 für das schwere Atlanto in. Anschließend wandeln Sie die Verhältnisse der Ionenabundanzen von Atlanto in zu schwerem Atlanto in unter Verwendung einer vorbereiteten Eichkurve in Mikromolar-Konzentrationen von Atlanto in um. Vor der Messung von MDA bereiten Sie Butylhydroxytoluol und 50 Millimolar-Phenylhydrazin-Lösungen gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Geben Sie M-M-D-A-B-H-T und Natriumcitrat zu der 100-Mikroliter-Plasma probe hinzu.Verdünnen Sie das Endgemisch durch Zugabe von destilliertem, deionisiertem Wasser auf 480 Mikroliter. Derivatisieren Sie die Lösung durch Zugabe von 20 Mikrolitern 50 Millimolar Phenolhydrazin. Inkubieren Sie die Lösung nach Verschluss des Gefäßes auf einem Rütteltablett. Nach der Inkubation ein Milliliter Hexan hinzufügen, das Gemisch eine Minute lang verwirbeln und 10 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren. Nach der Zentrifugation die organische Phase in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Anschließend die Lösung durch Verdampfen unter einem Strom von Stickstoffgas auf 100 Mikroliter eindampfen und in eine A-G-C-M-S-Datei mit einem 300-Mikroliter-Einsatz überführen.Als Nächstes analysieren Sie die Proben auf A-G-C-M-S unter Verwendung des Autosamplers, um die Trennung der Verbindungen und die Quantifizierung von MDA wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben durchzuführen. Beginnen Sie die Detektion der Santhe-Oxidase-Aktivität, indem Sie zwei Vials für Plasma­proben vorbereiten: eine zur Inkubation mit dem Substrat für null Minuten als Kontrolle und eine zur Inkubation für vier Stunden.Führen Sie wie im Experiment Puffer und Substrat zu jedem Reagenzglas hinzu. Inkubieren Sie die Proben vorab fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Starten Sie die Enzymreaktion, indem Sie 60 Mikroliter Plasma zu jedem Reagenzglas hinzufügen.Unmittelbar 300 Mikroliter 4 %ige Perchlorsäure zur Null-Inkubationsprobe hinzufügen. Umgekehrt die andere Mischung vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren lassen, bevor die Reaktion durch Zugabe von Perchlorsäure gestoppt wird. Die Null-Inkubationskontrollprobe vortexen und anschließend zentrifugieren. Entfernen Sie 500 Mikroliter des Überstandes und geben Sie ihn in ein Reagenzröhrchen, das 20 Mikroliter fünf molar Kaliumcarbonat enthält, um die Reaktion zu neutralisieren. Wirbeln Sie die neutralisierte Probe und zentrifugieren Sie ein zweites Mal. Anschließend geben Sie 350 Mikroliter der neutralisierten Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das zwei ap enthält. Nach der vierstündigen Inkubation beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 300 Mikrolitern 4 %iger Perchlorsäure.Fahren Sie mit der Probenaufbereitung wie bei der Kontrollprobe fort. Analysieren Sie die Proben mittels HPLC mit einem Scanning-Fluoreszenzdetektor. Geben Sie die Parameter unter Verwendung isokratischer Bedingungen bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute ein.Um eine ausreichende Trennung und Identifizierung der Peaks zu erzielen, stellen Sie die Anregungswellenlänge des Fluoreszenzdetektors auf 340 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 410 Nanometer drei 50 ein. Für jede Probe werden drei Injektionen von je 50 Mikroliter auf dem HPLC nach dem HPLC-Lauf durchgeführt. Bestimmen Sie das Verhältnis von ISO terin zu zwei AP, indem Sie die Peakflächen aus dem Spektrum des Fluoreszenzdetektors ermitteln.Der erste Peak im Spektrum bei etwa fünf Minuten entspricht zwei ap. Der zweite und größte Peak ist Terran. Der ISO-Antho-Terin-Peak eluiert zuletzt. Ermitteln Sie die Differenz der Verhältnisse der Peakflächen von ISO ANTOIN und zwei AP zwischen den Inkubationszeitpunkten null und vier Stunden.Verwenden Sie diesen Wert, um die Xanthinoxidase-Aktivität anhand der Standardkurven zu berechnen. Ein Beispiel für die HPLC-Quantifizierung von Purinverbindungen zeigt, dass die spezifischen Retentionszeiten und Emissionswellenlängen von Harnsäure, Hypoxanthin und Xanthin die gleichzeitige Quantifizierung von Purinverbindungen ermöglichen. Werden die Analyse korrekt durchgeführt, weisen die Verbindungen eine ausreichende Trennung auf, und die Peakform ist scharf und unimodal.Wenn sich Luftblasen im HPLC-System befinden, verschieben sich die Retentionszeiten und der HPLC-Druck schwankt stark. Wenn die Schutzpatrone gewechselt werden muss, steigt der Druck an und die Peaks verbreitern sich und werden bimodal oder trimodal, wie in diesem Beispiel hier gezeigt. Ein Beispiel der GCMS-Quantifizierung von Lanin wird gezeigt, da das massiv derivatisierte Lanin und das derivatisierte, schwere Lanin bekannt sind.Der Selektionsmodus für Ionen kann verwendet werden, um diese Verbindungen am Massenspektrometer zu identifizieren. Wenn der Test korrekt durchgeführt wird, werden zwei Peaks zur gleichen Retentionszeit beobachtet. Ein Peak entspricht Alan Toin und der andere dem schweren Toin.Die Ergebnisse zur Quantifizierung von MDA ähneln jenen für Alan Toin, mit der Ausnahme, dass hier zwei Peaks zu unterschiedlichen Retentionszeiten beobachtet werden. Dabei zeigt sich ein Master-Ladungsverhältnis-Peak bei 144 für MDA und ein Master-Ladungsverhältnis-Peak bei 158 für MMDA. Ein Beispiel zur HPLC-basierten Quantifizierung der Xanthinoxidase-Aktivität wird zur Null-Minuten-Inkubationszeit und zur Vier-Stunden-Inkubationszeit gezeigt.Wenn der Test korrekt durchgeführt wird, sollten drei Peaks mit dem Fluoreszenzdetektor beobachtet werden: einer für zwei ap, einer für Terran und einer für ISO terin. Beachten Sie, dass der ISO terin-Peak bei der vierstündigen Inkubationszeit aufgrund erhöhter Santhe-Oxidase-Enzymaktivität höher ist. Da dieser Test die Enzymfunktion misst, kann eine wiederholte Einfrierung und Auftauphase der Probe diese beeinflussen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie mehrere biochemische Marker der neonatalen Hypoxie-Ischämie genau gemessen werden können.

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Forschung

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Medizin

Hier schlagen wir einfache Methoden, um eine Hypoxie in Zellkulturen und einfache Tests veranlassen, die hypoxischen Zustand der Kulturen zu bewerten.

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Großtiermodelle haben gute translationale Werte in der Untersuchung der Physiologie und Pharmakologie von neonataler Asphyxie. Mit neugeborenen Ferkeln, entwickeln wir ein experimentelles Protokoll neonatale Asphyxie die Vorteile eines Studiums der systemischen und regionalen Hämodynamik, Sauerstoff-Transport mit biochemischen und pathologischen Wege und Zusammenhänge hat zu simulieren.

A Swine Modell von neonataler Asphyxie

Wir kombinierten Frequenz-Domain-Nahinfrarot-Spektroskopie Maßnahmen der zerebralen Oxygenierung des Hämoglobins mit diffuser Korrelations-Spektroskopie Maßnahmen des zerebralen Blutflusses Index einen Index der Sauerstoff-Stoffwechsel zu schätzen. Wir testeten den Nutzen dieser Maßnahme als Nachttisch Screening-Tool, um die Gesundheit und Entwicklung des Neugeborenen Gehirns zu beurteilen.

Non-invasive optische Messung des zerebralen Metabolismus und Hämodynamik bei Säuglingen

Hypoxisch-ischämische Enzephalopathie nach perinataler Asphyxie kann mit Tiermodellen untersucht werden. Wir demonstrieren die Verfahren, die zur Etablierung eines Ferkelmodells der neonatalen hypoxisch-ischämischen Enzephalopathie erforderlich sind.

Ein Ferkel Modell Neonatal hypoxischischämischer Enzephalopathie

Dieser Artikel beschreibt die Methodik für die Verwaltung von kurzen Perioden intermittierender Hypoxie zu postnatalen Tag 1-8 Maus oder Ratte Welpen. Dieser Ansatz effektiv löst eine robuste Gewebeniveau "Priming-Effekt" an kultivierten neuralen Vorläuferzellen, die innerhalb von 30 Minuten von Hypoxie Exposition geerntet werden.

Lieferung von<em&gt; In-vivo-</em&gt; Akuter intermittierender Hypoxie in Neonatal Nagetiere in den Prime Subventrikularzone abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellkulturen

Die chronisch instrumentierten nicht-narkotisierten fetaler Schafsmodell wird verwendet, um die menschliche Entwicklung des Fötus in Gesundheit und Krankheit zu studieren, weil es chirurgische Platzierung und Wartung von Katheter und Elektroden, repetitive Blutentnahme, Substanz Injektion, Aufnahme der bioelektrischen Aktivität und in vivo-Bildgebung ermöglicht. Wir beschreiben die erforderlich ist, um dieses Modell zu etablieren Verfahren.

Besetzung des Kurzfristige Fetal Schafe für Multivariate Chronische Non-narkotisierten Recordings

Mikrozirkulatorische Bildgebung (MI) wird verwendet, um die periphere Perfusion bei kritisch kranken oder frühgeborenen Neugeborenen zu überwachen. Dieses Manuskript und Video zeigt den optimalen Ansatz, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten.

Transkutane Mikrozirkulatorische Imaging in Frühgeborenen

Dieses Protokoll soll Ärzten helfen, die regionale Gewebesauerstoffversorgung an verschiedenen Körperstandorten bei Säuglingen und Kindern zu messen. Es kann in Situationen verwendet werden, in denen die Sauerstoffversorgung des Gewebes potenziell beeinträchtigt wird, insbesondere während des herzkarnierenden Bypasss, bei der Verwendung nicht-pulsatiler Herzhilfegeräte und bei kritisch kranken Neugeborenen, Säuglingen und Kindern.

Wie man Nahinfrarot-Spektroskopie bei kritisch kranken Neugeborenen, Säuglingen und Kindern verabreicht

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der regionalen Sauerstoffsättigung (rSO2) bei Hämodialysepatienten (HD) unter Verwendung eines Nahinfrarotspektroskopie-Monitors. DerrSO-2-Wert ist ein Index der Gewebeoxygenierung. Diese nichtinvasive und Echtzeitüberwachung könnte nützlich sein, um Veränderungen der Organoxygenierung während der Huntington-Krankheit zu bestätigen.

Messung der Gewebeoxygenierung mittels Nahinfrarotspektroskopie bei Patienten, die sich einer Hämodialyse unterziehen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Hypoxie bei neugeborenen Mäusen zu induzieren, indem sie in kontrollierten Umgebungen mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen verabreicht werden. Mausmodelle, die bei der Geburt Sauerstoffschwankungen ausgesetzt waren, haben die Expression von miRNAs, die an der Induktion von phänotypischen Verhaltensänderungen wie Autismus beteiligt sind, dauerhaft variiert.

Hypoxie verändert miRNAs-Spiegel, die an der nicht-Mendelschen Vererbung der Autismus-Spektrum-Störung bei Mäusen beteiligt sind

Erfahren Sie die biochemische Messung von Hypoxie bei Neugeborenen mittels HPLC und GC/MS. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Purinen, Allantoin, MDA und Xanthinoxidase-Aktivität im Plasma zur Diagnose neonataler Hypoxie-Ischämie.

Biochemische Measurement of Neonatal Hypoxie

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