Targeting Riechhirn Neuronen mit kombinierten In Vivo Elektroporation und Gal4-Based Enhancer-Trap Zebrafischlinien

Diese Methode veranschaulicht, wie die Kombination einer zeitlich und räumlich gezielten in vivo-Elektroporation mit transgenen Linien von Zebrafischen die gezielte Expression von Transgenen in bestimmten Bereichen des sich entwickelnden Embryos ermöglicht. Beginnen Sie mit cal TA vier transgenen Fischen, die mittels Enhancer-Trap-Methode generiert wurden, um die Genexpression und die Zelltypen von Interesse einzuschränken. In diesem Fall wird in die sich entwickelnde Riechbülbe zu einem bestimmten Zeitpunkt der Entwicklung das GFP-Reporterplasmid in das vordere Ende des Vorderhirns in vivo injiziert und eine Elektroporation durchgeführt, um die DNA-Übertragung zu erleichtern. Die Ergebnisse, die mittels in vivo-Fluoreszenzbildgebung erhalten wurden, zeigen eine präzise Lokalisation des Transgens zu einem bestimmten Zeitpunkt und Entwicklungsprozess.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Injektion von Plasmid im Ein-Zell-Stadium besteht darin, dass die Expression gezielt auf bestimmte Zelltypen innerhalb eines spezifischen Bereichs des sich entwickelnden Gehirns ausgerichtet ist. Verwenden Sie die transgene Zebrafisch-Linie, die mittels einer vermittelten Enhancer-Trap-Methode erzeugt wurde, um die Expression sowohl des Transkriptionsfaktors calt A vier als auch des Reportereiweißes M cherry in bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirns anzustoßen. Stellen Sie eine Kreuzung von adulten Fischen, die heterozygot für das transgene Insert sind, mit Wildtyp-Fischen ein, um etwa 50 % transgene Nachkommen zu erhalten.

Behandeln Sie transgene Embryonen nun mit 100 Mikromolar Phenylthioharnstoff, beginnend sechs bis acht Stunden nach der Befruchtung, um die Pigmentbildung zu blockieren und die fluoreszenzgestützte Bildgebung 24 bis 28 Stunden nach der Befruchtung zu erleichtern. Überführen Sie die Embryonen in Ei-Wasser ohne PTU und identifizieren Sie transgene Embryonen unter dem Fluoreszenzmikroskop anhand der Expression von mCherry im Mikrowellenbereich. Bereiten Sie eine 0,5%-ige Lösung von Low-Melting-Point-Agarose im Elektroporationspuffer mit Trica vor und äquilibrieren Sie anschließend die Lösung.

Platzieren Sie in einem Inkubator mit 34 bis 37 Grad Celsius einen großen Tropfen von etwa 500 Mikrolitern der Agro-Lösung in die Mitte einer 60 Millimeter großen Petrischale. Entfernen Sie mit feinen Pinzetten die Corian-Membran von transgenen Embryonen. Überführen Sie die freigesetzten Embryonen für zwei Minuten in eine Petrischale, die Elektroporationspuffer mit 0,02 % Trica-Anästhetikum enthält.

Überführen Sie nun sechs bis acht anästhetisierte Embryonen mit abgeschnittenen Michael-Loader-Pipettenspitzen in den vorbereiteten Tropfen mit Aros. Positionieren Sie die Embryonen so, dass sie alle in dieselbe Richtung zeigen und in einer vertikalen Reihe ausgerichtet sind. Fixieren Sie die Embryonen in Position, indem Sie das Aros mit einer großen Petrischale, die zwei bis drei Millimeter Eis enthält, verfestigen.

Überfluten Sie die Petrischale mit Elektroporationspuffer plus Trica, wobei sichergestellt werden muss, dass die Lösung den erstarrten Aros-Tropfen vollständig bedeckt. Bereiten Sie das gereinigte GFP-Expressionsplasmid mit Phenolrot-Farbstoff für die Injektion vor. Stellen Sie nun Mikroinjektionspipetten unter Verwendung einer Mikrolader-Pipettenspitze her.

Geben Sie ein bis zwei Mikroliter DNA-Plasmidlösung in die Injektionspipette und montieren Sie die beladene Pipette dann sicher im Pipettenhalter des Druckinjektionssystems. Brechen Sie die beladene Pipette zurück, indem Sie sie kräftig durch ein untergetauchtes Kim-Tuch einführen, bis Druckimpulse eine POF-Freisetzung der roten DNA-Lösung bewirken, wobei die Pipette auf das vordere Ende des sich entwickelnden Gehirns gerichtet ist. Injizieren Sie die Plasmid-DNA-Lösung mittels Druckinjektion in die Ventrikel des sich entwickelnden Gehirns.

Zwingen Sie die DNA in einen Bereich neben dem zukünftigen Riechkolben. Injizieren Sie DNA, bis die rote Farbe deutlich am vorderen Ende des Vorderhirnventrikels sichtbar ist. Fahren Sie unmittelbar mit dem Elektroporationschritt fort, um eine Diffusion und Verdünnung der DNA zu verhindern.

Stellen Sie den SD-nine-Stimulator so ein, dass einzelne fünf Millisekunden lange Elektroporationsimpulse erzeugt werden, bei 70 Volt. Positionieren Sie die Elektroden so, dass sich die positive Elektrode neben dem inneren Ende des Embryos befindet, während die negative Elektrode hinter dem Embryokopf liegt.

Manuell acht Elektropulsimpulse mit einem einzelnen Mote-Schalter des SD-nine-Stimulators auslösen. Die einzelnen Impulse mit jeweils einer Sekunde Abstand voneinander ausführen. Den Embryonen eine Erholungszeit von mindestens 10 Minuten gewähren.

Verwenden Sie nun feine Pinzette, um vorsichtig den Umriss der Embryonen nachzuzeichnen, wobei ein direkter Kontakt mit den Embryonen selbst vermieden werden sollte. Lösen Sie anschließend die Embryonen vom Agar. Geben Sie die Embryonen in frisches Ei-Wasser zurück und lagern Sie sie bei 28 Grad Celsius, bis die Analyse der GFP-Expression erfolgt.

Überführen Sie die Embryonen wie zuvor für mehrere Minuten in Ei-Wasser mit 0,02 % Trica-Anästhetikum in die Mitte einer kleineren 35-Millimeter-Petrischale. Geben Sie einen großen Tropfen einer 0,5%igen Lösung aus Low-Melting-Point-Agarose und Ei-Wasser mit Trica hinzu. Fügen Sie nun mithilfe abgeschnittener Mikrolader-Pipettenspitzen einen anesthetisierten Embryo zu diesem Agarosetropfen hinzu.

Positionieren Sie das Embryo aufrecht, um eine dorsale Ansicht des sich entwickelnden Gehirns unter einem aufrechten Mikroskop zu ermöglichen. Lassen Sie das Aros auf Eis erstarren und verwenden Sie abgeschnittene Mikroladertipps, um die Orientierung des Embryos beizubehalten. Schließlich überschwemmen Sie die Petrischale mit Ei-Wasser plus Trica, wobei sichergestellt werden muss, dass die Lösung den erstarrten Aros-Tropfen vollständig bedeckt.

Dieses Beispiel kombiniert die zeitliche Auflösung der in-vivo-Elektroporation mit einer zelltypspezifischen Expression, die durch Enhancer-Trap-Transgenlinien vermittelt wird, um die Entwicklung der Riechbülbe gezielt anzusteuern. Die transgene Enhancer-Trap-Linie zeigt eine konstitutive Expression von mCherry und Calretinin A4 im Kleinhirn des Hinterhirns, im Vorderhirn und in der Riechbülbe von Embryonen fünf Tage nach der Befruchtung. Wichtig ist, dass die GFP-exprimierenden Zellen vier Tage nach der Elektroporation typische axonale Projektionen von Riechbülben-Mitralzellen aufweisen.

Der Vergleich der Signale von M-Cherry und der geringeren Belichtung von GFP zeigt, dass die Zellkörper, die GFP exprimieren, tatsächlich im Riechkolben lokalisiert sind. Unter Verwendung von Short-hairpin-RNA-Konstrukten. Dieses Verfahren kann ebenfalls verwendet werden, um einen Funktionsverlust in spezifischen Zelltypen des sich entwickelnden Gehirns zu induzieren.