Name: Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Erfahren Sie eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Motilität äußerer Haarzellen mit elektrischer Wechselfeldstimulation und Hochgeschwindigkeitsbildanalyse. Diese Technik ermöglicht präzise Einblicke in die Cochlea-Funktion und Hörforschung.

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Arbeit unterstützt von den National Institutes of Health Grants R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Forschung Core und HEI. Sein Inhalt ist ausschließlich die Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH oder HEI. Die Autoren erklären, keine bestehenden oder potenziellen Interessenkonflikt.

1. Isolierung von OHCs <ol><li> Begin dieses Verfahren durch die Ernte Felsenbeine von Meerschweinchen, Mäuse oder Ihre Säugetierabfällen Modell. </li><li> Dann öffnen Sie den zeitlichen Knochen mit einem Hammer Zange, um die Cochlea aussetzen, und tauche sie in Leibovitz L-15. Entfernen Sie überschüssige Knochen vorsichtig, halten die knöchernen Schale intakt. Diese ist ein allgemeines Verfahren für Felsenbeine von Säugetieren können kleinere Änderungen an der Technik notwendig sein, wenn es um zeitliche Knochen von sehr kleinen Tieren. In alten Tieren der Bulla ist in der Regel verkalkt, die Einführung einer zusätzlichen Komplikation des Verfahrens. </li><li> Unter mikroskopischer Beobachtung, öffnen Sie den apikalen Bereich der Cochlea und beseitigen Stria vascularis und Ligamentum spirale mit der Spitze eines Nr. 11 Skalpell, wählen Sie eine Micro-Punkt und einer Geldstrafe Pinzette. </li><li> Nehmen Sie das Corti-Organ aus dem Cochlea-Modiolus mit der Pinzette, und steckte es in 1mg/ml Kollagenase in L-15 bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Wenn OHCs von basalen Windungen der Cochlea benötigt werden, entfernen Sie die knöcherne Hülle um die Basis der Schnecke mit der Abholung, und trennen Sie die Spirale aus dem Schläfenbein mit dem Skalpell, bevor Sie das Corti-Organ. </li><li> Übertragen Sie die Corti-Organ, um die Aufnahme Kammer mit einem 50 ul Hamilton-Spritze. Danach distanzieren Zellen durch Rückfluss durch die Nadel. </li></ol> 2. Versuchsaufbau <ol><li> Schematische Darstellung des externen elektrischen Wechselfeld (EAEF) Generator und ihre Verbindungen mit dem Bild-Capture-System (Abb. 1). Die Steuerschaltung wurde speziell auf die Engineering-Core des House Ear Institute umgesetzt. </li><li> Der Versuchsaufbau ist in unseren Experimenten verwendet besteht aus einem Axiovert 135TV inversen Mikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) mit einer alternativen LED-basierte Beleuchtung (High Power LED System-36AD3500, Lightspeed Technologies, Campbell, CA), zwei elektronische Mikromanipulatoren (Eppendorf "PatchMan", Deutschland), eine PC-gesteuerte ultra-High-Speed-Photron FastCAM X 1024 PCI-Kamera (Photron USA Inc.) in den Keller-Anschluss und einen zusätzlichen regulären CCD-Kamera in der trinokularen Port. Die FastCAM Kamera kann Bilder bei hohen Frequenzen (bis zu 100.000 fps) und hoher Auflösung (zB 1024 x 1024 Pixel bei 1.000 fps, 512 x 128 bei 10.000 fps, 384 x 96 bei 18.000 fps, und so weiter) zu erfassen. Die Bilder von der High-Speed-Kamera zur Verfügung gestellt werden direkt in den PC-Monitor beobachtet, während die CCD-Kamera auf einen anderen Monitor angeschlossen ist. Die LED-Beleuchtung-System arbeitet in zwei verschiedenen Modi: Low-Power-Analog-und High-Power-digital. Alle vorläufigen Verfahren (Elektroden positioniert, Zell-Positionierung, Fokus, usw.) werden unter Verwendung der Low-Power-Analog-Modus. Die High-Power-Beleuchtung wird durch die Öffnung der Verschluss der Kamera eingeschaltet und dann ausgeschaltet, indem Verschlussgeräusch, die Erleichterung Wärmeableitung. Homemade-Software, auch bei der House Ear Institute Maschinenbau-Core entwickelt, die auf dem gleichen PC steuert die Auslöser der High-Speed-Kamera, die LED-basierte Beleuchtung, und die EAEF. Eine herkömmliche Digitalkamera in der Front-Port können Standbilder, wie gebraucht. (Abb. 2 A). </li><li> Elektroden (zwei 0,25 mm-Durchmesser Ag Drähte mit Spitze Abstand von 0,8 mm) angetrieben werden, um Position mit einer der elektronische Mikromanipulatoren. Elektroden-Position wird visuell und durch das mikroskopische Bild beobachtet; eine Änderung in der Brennebene des Bildes zeigt an, dass die Elektroden der Unterseite des experimentellen Kammer berührt. Zunächst wird das elektrische Feld kalibriert mit einem externen Elektrode. Diese Elektrode misst das elektrische Potential an verschiedenen Punkten, wodurch eine "Landkarte" des elektrischen Feldes. Wenn ein einzelner isolierter äußeren Haarzellen ist zwischen den Spitzen der Elektroden mit seiner Längsachse parallel zum angelegten EAEF platziert, wird sie bewegen verlängert und verkürzt auf der gleichen Frequenz des elektrischen Feldes. Wenn die Zelle senkrecht zum Feld platziert eine andere Art von OHC Antwort (Biegen) können beobachtet und untersucht werden. (Abb. 2 B) </li></ol> 3. EAEF Stimulation und Bilderfassung <ol><li> Vier verschiedene Stimulationsprotokolle sind wählbar (Abb. 3): <ol><li> kontinuierliche einzigen Frequenz (Abb. 3 A). Beachten Sie, dass Stimulus-Modus, Frequenz, Amplitude und Wellen-Typ ausgewählt werden mit dem hausgemachten Steuerungs-Software (rote Kreise) werden. </li><li> bursted einzigen Frequenz (Abb. 3 B). Die Länge des Bursts und Lücken zwischen Burst sind auch wählbar. </li><li> linear sweep (Abb. 3 C). Die Anfangs-und End-Frequenzen sind wählbar. </li><li> Multi-Stimulation (Abb. 3 D). Einzel-Frequenz und linear fegt können in einem einzigen Experiment kombiniert werden. Nach Auswahl der entsprechenden Parameter konfiguriert der Steuerungs-Software des Systems und ermöglicht dem Bediener, Licht-synchronisierte Videoaufzeichnung und-Zell-Stimulation durch Klicken auf einen einzigen Tastendruck in initiierendem Computer-Bildschirm. </li></ol></li><li> Die Bilder werden im AVI-Format zur weiteren Analyse bei hohen Frequenzen erfasst. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> In diesem Film zeigen zwei isolierten äußeren Haarzellen Veränderungen in der Länge oder Krümmung, wenn sie als mit einer externen elektrischen Wechselfeld, das parallel oder quer ist, bzw. stimuliert, um ihre Längsachse. (Movie # 2). </li><li> OHCs bewegliche Antworten sind off-line mit ProAnalyst Software (Xcitex Inc., Cambridge, MA) analysiert. "Feature Tracking"-Funktion in dieser Software bietet die Entfernung zwischen zwei Punkten Frame-by-Frame (Abb. 4). Bei der Zellteilung verkürzen die Distanz zwischen den Punkten an der Spitze (Kutikularplatte; rote Farbe) ausgewählt und die Basis der Zelle (Basal-polig; grüne Farbe) kleiner ist, und nimmt mit der Zellstreckung. Der Film zeigt die Software die Analyse Frame-by-Frame die Änderungen in der Länge. Die Leiste am unteren Rand des Bildes zeigt die Spur der Bewegung. In diesem Beispiel ist die totale Veränderung in der Länge etwa 6,5 ​​Pixel. </li><li> "Contour Tracking"-Funktion in ProAnalyst Software kann erkennen, Zellkante und automatisch messen dem Bereich der optischen Schnitt (Abb. 5). </li><li> Polystyrol-Mikrokugeln hinzugefügt, um die Badlösung zufällig und fest an der Plasmamembran (Abb. 6 A) befestigen. Verschiedene Mikrosphären können gleichzeitig ausgewählt werden, und die Software kann automatisch verfolgen sie alle Frame für Frame. Auf diese Weise können die Zellen in Abschnitte unterteilt werden und die Beweglichkeit der einzelnen Abschnitte ausgewertet unabhängig. (Abb. 6 A) </li><li> Durch die Auswahl Mikrosphären an den seitlichen Rändern der Zelle Bild befindet, Veränderungen in der Länge der einzelnen Segmente und Änderungen in Winkel von einem Segment in Bezug auf andere (Biegen) können auch unabhängig voneinander beurteilt werden. (Abb. 6B) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der EAEF Generator und ihre Verbindungen mit dem Bild-Capture-System. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. A) Bild des Versuchsaufbaus. B) Detail des Mikroskoptisches, mit Karikaturen der Elektroden und einem OHC platziert zwischen ihnen mit seiner Längsachse parallel zum elektrischen Feld. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. A) Benutzeroberfläche des hausgemachten Steuerungs-Software für Single-Frequency-Stimulation konfiguriert. Die ausgewählten Parameter werden in rot eingekreist. B) Die Benutzerschnittstelle des hausgemachten Steuerungs-Software für Burst Single-Frequency Stimulation konfiguriert. C) Die Benutzerschnittstelle des hausgemachten Steuerungs-Software für Linear Sweep Stimulation konfiguriert. D) Die Benutzerschnittstelle des hausgemachten Steuerungs-Software für Multi-Stimulation konfiguriert. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Einzelbild eines OHC mit zwei Punkten an der Basis (grün) und die Spitze (rot) der Zelle bzw. mit dem "Feature-Tracking"-Funktion des ProAnalyst Software selektiert. Die Kurve unterhalb der Zelle zeigt die periodischen Änderungen des Abstands zwischen den ausgewählten Punkten mit elektrischen Stimulation verbunden ist. Verschieben Sie die vertikale Leiste verschiedenen Rahmen können für einzelne Analyse ausgewählt werden. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Der "Contour Tracking"-Funktion in ProAnalyst erkennt die Zelle Rand und automatisch messen dem Bereich der optischen Schnitt. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. A) Das aufgenommene Bild eines isolierten OHC mit Polystyrol-Mikrosphären (oben), und das gleiche Bild mit fünf Mikrosphären individuell ausgewählt (unten) verziert. Eine andere Farbe wurde auf jedes Mikrokügelchen zugewiesen, und ihre Verschiebungen lassen sich individuell und automatisch verfolgt werden Frame für Frame, analysiert und verglichen. B) Segmente von beliebiger Länge kann durch die Auswahl Polystyrol-Mikrosphären an den Rändern der Zelle befindet definiert werden, und Änderungen in der Länge dieser Segmente sowie Änderungen in der Ausrichtung von einem Segment in Bezug auf andere (Zelle Biegen) können automatisch ausgewertet werden Frame für Rahmen mit der Bildanalyse-Software. Movie 1. Isolation von Meerschweinchen OHCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a> Movie 2. OHCs parallel und senkrecht zur EAEF zeigt typische Elektromotilität und Biegen Antworten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">Klicken Sie hier, um Video anzuschauen</a>

<ol><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li>
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<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility%3A+effects+of+the+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInou%C3%A9%2C+S+%22Video+Microscopy%22">Video Microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1986).</li>
</ol>

Die experimentelle Methode hier vorgestellten ermöglicht die Schätzung OHC motile Reaktionen in den kHz-Bereich ohne Einschränkung auf die Zelle der Bewegung. Verschiedene Stimulationsprotokolle, zusätzliche Markierungen (Mikrosphären), sowie Veränderungen in der Ausrichtung der Zelle in Bezug auf das elektrische Feld, machen es möglich, neue Aspekte der OHC Motilität mit einer Detailgenauigkeit bisher unzugänglichen untersuchen. Andere Methoden, z. B. die Verwendung von Fotodioden 9 oder Laser-Doppler 1...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase (Typ 4) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 1mg/ml in L-15 </td></tr></tbody></table>

die untersuchung der äußeren haarzellen motilität mit einer kombination von externen elektrischen wechselfeld stimulation und high-speed-image analysis

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCs sind zylindrisch sensomotorischen Zellen im Corti-Organ, das Hörorgan im Inneren des Säuger-Innenohrs befindet. Der Name &quot;Haarzellen&quot; leitet sich von ihrer charakteristischen apikalen Bündel von Stereozilien, ein entscheidendes Element für die Detektion und Transduktion von Schallenergie 1. OHCs der Lage sind, verändern ihre Form-länglich, zu verkürzen und biegen in Reaktion auf elektrische, mechanische und chemische Stimulation, als eine motorische Reaktion entscheidend für Cochlea Verstärkung der akustischen Signale 2. OHC Stimulation induziert zwei verschiedene bewegliche Antworten: i) Elektromotilität, auch bekannt als schnelle Motilität, Veränderungen in der Länge im Bereich von Mikrosekunden von elektrisch angetriebenen Konformationsänderungen in Motorproteine ​​dicht in OHC Plasmamembran verpackt abgeleitet, und ii) langsam Beweglichkeit, Form Veränderungen in der Millisekunde bis Sekundenbereich mit Zytoskelett-Reorganisation 2, 3. OHC Biegen ist mit Elektromotilität verbunden sind, und das Ergebnis entweder von einer asymmetrischen Verteilung der Motorproteine ​​in den seitlichen Plasmamembran, oder asymmetrische elektrische Stimulation dieser Motorproteine ​​(zB mit einem elektrischen Feld senkrecht zur Längsachse der Zellen) 4. Mechanische und chemische Reize auslösen Wesentlichen langsam bewegliche Antworten, auch wenn Veränderungen in der ionischen Bedingungen der Zellen und / oder deren Umgebung kann auch Impulse für die Plasmamembran-embedded Motorproteine ​​5, 6. Da OHC bewegliche Antworten ein wesentlicher Bestandteil des cochleären Verstärkers, die qualitative und quantitative Analyse dieser beweglichen Reaktionen auf akustische Frequenzen (etwa von 20 Hz bis 20 kHz beim Menschen) sind, ist ein sehr wichtiges Thema im Bereich des Hörens Forschung 7. Die Entwicklung neuer Imaging-Technologie kombiniert Hochgeschwindigkeits-Videokameras, LED-basierten Beleuchtungssystemen und ausgefeilte Bildanalyse-Software bietet nun die Möglichkeit, zuverlässige qualitative und quantitative Untersuchungen der beweglichen Reaktion von isolierten OHCs an ein externes elektrisches Wechselfeld (EAEF) durchführen 8. Dies ist eine einfache und nicht-invasive Technik, die die meisten der Grenzen der bisherigen Ansätze 9-11 umgeht. Darüber hinaus bietet die LED-basierte Beleuchtung System extreme Helligkeit mit unbedeutenden thermischen Auswirkungen auf die Proben und wegen der Verwendung von Video-Mikroskopie, ist die optische Auflösung mindestens 10-fach höher als bei konventionellen Lichtmikroskopie Techniken 12. Zum Beispiel mit dem Versuchsaufbau hier beschrieben, können Veränderungen in der Zelle Länge von etwa 20 nm routinemäßig und zuverlässig bei Frequenzen von 10 kHz erfasst, und diese Auflösung kann bei niedrigeren Frequenzen verbessert werden. Wir sind zuversichtlich, dass dieser experimentelle Ansatz wird dazu beitragen, unser Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die OHC Beweglichkeit zu erweitern.

Eine zuverlässige Methode, um der äußeren Haarzellen (OHC) beweglich Reaktionen, einschließlich Elektromotilität, langsame Motilität und Biegen, untersuchen beschrieben. OHC Motilität wird durch die Stimulation mit einem externen elektrischen Wechselfeld, und die Methode nutzt die Highspeed-Aufnahme, LED-Beleuchtung, und die letzte Generation Bildanalyse-Software.

Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis

Äußere Haarzellen (OHCs) sind zylindrische sensorimotorische Zellen, die sich im Corti-Organ befinden, dem Hörorgan im Innenohr der Säugetiere. Der Name „Haarzellen“ leitet sich ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Bewegungsreaktionen äußerer Haarzellen oder OHCs vorzustellen, einschließlich Elektromotilität, langsamer Motilität und Verbiegung bei akustischen Frequenzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Schläfenbeine von Meerschweinchen, Mäusen oder anderen Säugetieren entnommen und die Paukenhöhle geöffnet werden, um das Cochlea freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, das Cochlea in Lebovits L 15 einzutauchen, den apikalen Bereich der knöchernen Hülle, das Spiralband und das Stria vascularis zu entfernen und das Corti-Organ zu isolieren.Nach einer fünfminütigen Inkubation des Corti-Organs in Kollagenase (1 Milligramm pro Milliliter) wird es mit einer 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze in die Aufzeichnungskammer überführt, und die Zellen werden durch Rückführung durch die Nadel dissoziiert. Anschließend wird die Aufzeichnungskammer unter das Mikroskop gebracht, um die Zellen mit einem äußeren, wechselnden elektrischen Feld zu stimulieren und die beweglichen Reaktionen isolierter äußerer Haarzellen mittels einer Hochgeschwindigkeitskamera aufzuzeichnen. Letztendlich können äußere Haarzellen, Elektromotilität, langsame Motilität und Verbiegung bei akustischen Frequenzen durch computerunterstützte Bildanalyse ausgewertet werden.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Schläfenbeine von Meerschweinchen, Mäusen oder anderen säugetierischen Tiermodellen entnehmen. Öffnen Sie anschließend die Schläfenbeine mit einer Auls-Zange. Um das Cochlea freizulegen, entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Knochenmaterial, wobei die knöcherne Hülle des Cochlea intakt bleiben muss, und tauchen Sie es in Livi L 15 ein.Öffnen Sie unter dem Mikroskop den apikalen Bereich der Cochlea. Entfernen Sie den Trockner, die VASIs und das Spiralband mit der Spitze einer Skalpellklinge, einem Mikropunkt-Pick oder einer feinen Pinzette. Entfernen Sie das Corti-Organ mit der Pinzette aus der Cochleamodiolus.Als Nächstes geben Sie das Cochlea in eine Lösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Falls Haarzellen aus den basalen Windungen des Cochlea benötigt werden, entfernen Sie die knöcherne Hülle, die die Basis des Cochlea bedeckt, mit dem Präparationsbesteck und lösen Sie die Spirale mit der Skalpellklinge vom Schläfenbein. Bevor Sie das Corti-Organ entfernen, überführen Sie das Corti-Organ mit einer 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze in die Aufnahmekammer. Anschließend dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie sie mehrfach durch die Nadel der Spritze ziehen.Hier ist das Diagramm des externen Wechselstrom-Elektrikfeldgenerators und der Verbindungen zum Bildaufnahmesystem, der Steuerschaltung und der Software, die speziell im technischen Kern des House Ear Institute implementiert wurde. Der im Experiment verwendete Versuchsaufbau besteht aus einem umgekehrten Axia vert 1 3 5 TV-Mikroskop mit einem alternativen, LED-basierten Beleuchtungssystem und zwei elektronischen Mikromanipulatoren. Am Mikroskop sind drei Kameraanschlüsse vorhanden: Eine PC-gesteuerte ultraschnelle Photron Fastcam PCI-Kamera mit 1024 × 1024 Pixel Auflösung im Teleport, die Bilder mit hohen Frequenzen bis zu 100.000 Bildern pro Sekunde (FPS) aufnimmt.Die Bilder, die von der Hochgeschwindigkeitskamera bereitgestellt werden, werden direkt auf dem PC-Monitor beobachtet. Eine zusätzliche reguläre CCD-Kamera am Okularanschluss ist mit einem hochauflösenden Monitor verbunden. Eine herkömmliche digitale Foto-Kamera am Frontanschluss ermöglicht die Aufnahme von Standbildern. Eine hausgemachte Software, die auf demselben PC läuft, steuert den Auslöser der Hochgeschwindigkeitskamera, das Beleuchtungssystem und die externe montierte Wechselstrom-Elektrode.Die beiden Elektroden bestehen aus zwei Silberdrähten mit einem Durchmesser von 0,25 Millimetern und einem Spitzenabstand von 0,8 Millimetern an einem elektrischen Mikromanipulator. Kalibrieren Sie anschließend das elektrische Feld mithilfe einer externen Elektrode. Diese Elektrode misst das elektrische Potential an verschiedenen Punkten und erzeugt so eine Karte des elektrischen Feldes.Wenn eine einzelne isolierte äußere Haarzelle zwischen die Spitzen der Elektroden platziert wird, wobei ihre Längsachse parallel zum angelegten wechselnden elektrischen Feld ausgerichtet ist, bewegt sie sich, indem sie sich mit derselben Frequenz wie das elektrische Feld verlängert und verkürzt. Beispielsweise wird hier eine Zelle dargestellt, die mit 50 Hertz stimuliert und mit 1000 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet wird. Dieses nächste Bild zeigt eine Zelle, die mit vier Kilohertz stimuliert und mit 18.000 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet wird.Wenn die Zelle senkrecht zum Feld platziert wird, kann eine andere Art der Biegungsreaktion der äußeren Haarzellen beobachtet und untersucht werden. Diese Zelle beispielsweise verbiegt sich, wenn sie mit einem elektrischen Feld senkrecht zu ihrer längeren Achse bei 50 Hertz stimuliert wird. Äußere Haarzellen können Formänderungen als Reaktion auf nichtelektrische Reize zeigen.Diese Reaktion wird als langsame Motilität bezeichnet und kann ebenfalls mit dieser Technik untersucht werden. Wählen Sie unterschiedliche Stimulationsarten aus den vier verschiedenen Protokollen aus. Das erste ist die kontinuierliche Einzelfrequenz.Beachten Sie, dass der Stimulationsmodus, die Frequenz, die Amplitude und der Wellentyp ausgewählt werden können, was durch rote Kreise mit der selbstgebauten Steuerungssoftware angezeigt wird. Das zweite Stimulationsprotokoll ist die gebündelte Einzelfrequenz, bei der die Länge der Pulse und die Pausen zwischen den Pulsen einstellbar sind. Das dritte ist der lineare Frequenzsweep, bei dem die Anfangs- und Endfrequenzen justierbar sind.Das vierte Stimulationsprotokoll ist die Multistimulation, die es ermöglicht, verschiedene Stimulationsmodi zu kombinieren. Nach Auswahl der entsprechenden Parameter konfiguriert die Steuersoftware das System und ermöglicht es dem Bediener, durch Anklicken einer einzigen Schaltfläche auf dem Computerbildschirm eine lichtsynchronisierte Videoaufnahme und Zellstimulation zu starten. In diesem Film sind Veränderungen der Länge oder Krümmung der isolierten äußeren Haarzellen zu sehen, wenn sie mit einem externen, alternierenden elektrischen Feld stimuliert werden, das jeweils parallel oder transversal zu ihrer Längsachse ausgerichtet ist.Die Antworten der äußeren Haarzellen werden offline mithilfe der Merkmalsverfolgungsfunktion der Pro-Analysts-Software analysiert. Hier ist eine äußere Haarzelle dargestellt, die mit einer Frequenz von 50 Hz stimuliert und mit 1000 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet wurde. Die Software liefert den Abstand zwischen zwei Punkten bildweise, wie hier während der Zellverkürzung gezeigt. Der Abstand zwischen den am Zellende ausgewählten Punkten, rot markiert als Cuticulaplatte, und der Zellbasis, grün markiert als basales Pol, ist geringer und nimmt bei Zellverlängerung zu. Die Software führt eine bildweise Analyse der Änderungen in der Länge der äußeren Haarzelle durch.Das Feld unten im Bild zeigt die Spur der Bewegung. In diesem Beispiel beträgt die gesamte Änderung der Länge etwa 6,5 Pixel. Hier ein Beispiel, das zeigt, dass die Zellkante erkannt werden kann und die Fläche des optischen Schnitts automatisch durch die Konturverfolgungsfunktion mit der Pro-Analys-Software gemessen werden kann.In diesem Experiment werden Polystyrol-Mikrokügelchen zufällig der Badlösung hinzugefügt und fest an der Plasmamembran angeheftet. Verschiedene Mikrokügelchen können gleichzeitig ausgewählt werden, und die Software kann alle von ihnen Bild für Bild automatisch verfolgen. Auf diese Weise können die Zellen in Abschnitte unterteilt werden, und die Beweglichkeit jedes Abschnitts kann unabhängig voneinander bewertet werden.Indem man die Mikrokügelchen an den seitlichen Rändern der Zelle auswählt, können Bildänderungen in der Länge jedes Segments sowie Änderungen im Winkel eines Segments gegenüber dem anderen unabhängig voneinander bewertet werden. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden.Selbstverständlich ist zusätzliche Zeit für die Offline-Analyse der aufgezeichneten Filme erforderlich. Mit geeigneter Software kann diese Analyse jedoch pro Film in etwa drei weiteren Stunden abgeschlossen werden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bewegungsreaktionen äußerer Haarzellen untersucht, einschließlich Elektromotilität, langsamer Motilität und Biegung bei akustischen Frequenzen.

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Whole-Cell-Patch-Clamp Messungen von auditiven Nervenfaser Dendriten an der inneren Haarzelle ribbon Synapsen im Säuger-Cochlea.

Postsynaptische Recordings am afferenten Dendriten Kontaktaufnahme mit Cochlear inneren Haarzellen: Monitoring multivesikulären Veröffentlichung in einem Ribbon Synapse

Dieses Video zeigt die kombinierte Aufzeichnung von mechanisch stimulierter afferenter Ausgabe und Nervenendmarkierung in den Haarfollikeln einer Ohrmuschel einer Maus. Es beschreibt die Schritte bei der mechanischen Stimulation der Nervenendigungen der Haarfollikel vor und nach der Exposition gegenüber einem fluoreszierenden Membranfarbstoff, die elektrophysiologische Aufzeichnung der erzeugten Aktionspotentiale und die Visualisierung der Markierung der Nervenenden in den Haarfollikeln.

Kombinierte Aufzeichnung der mechanisch stimulierten afferenten Ausgabe und der Markierung der Nervenenden in Haarfollikeln von Mäusen

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Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

In dieser Studie wurde eine detaillierte lichtmikroskopische Technik für die Echtzeitbeobachtung und -analyse der Bewegung von CPEC-Zilien ex vivo zusammen mit einer elektronenmikroskopischen Methode zur Ultrastrukturanalyse optimiert.

Beobachtung der Flimmerbewegung von Plexus Epithelzellen<em&gt; Ex Vivo</em

Eine einfache und neuartige Technik zur Aufzeichnung afferenter Entladung aufgrund mechanischer Stimulation von lanzettlichen Enden von Palisadenenden, die Mausohren, Haut, Haarfollikel innervieren, wird vorgestellt.

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

Hier beschreiben wir ein neuartiges Präparat zur Abbildung lebender lanzettlicher sensorischer Enden von Palisadenenden, die Mausohren, Haut, Haarfollikel während des Färbens und Entfärbens mit Styrylpyridiniumfarbstoffen innervieren.

Optische Überwachung der Lebensnervenendigung Beschriften in Haarfollikel Lanceolate Endigungen der<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus-Ohr-Haut

Die amerikanischen Ochsenfrosches ist (Rana catesbeiana) sacculus ermöglicht die direkte Untersuchung von Haarzellphysiologie. Hier ist die Präparation und Vorbereitung der sacculus des Ochsenfrosch für biophysikalische Studien beschrieben. Wir zeigen repräsentative Experimente aus diesen Haarzellen, einschließlich der Berechnung eines Bündels der Kraft-Weg-Beziehung und Messung seiner ungezwungenen Bewegung.

Physiologische Herstellung von Haarzellen aus dem Sacculus der American Bullfrog (<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um die auditory Brainstem Antwort vom postnatalen Ratte Welpen aufnehmen. Um die funktionelle Entwicklung des äußeren Haarzellen zu untersuchen, ist das experimentelle Verfahren der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme in isolierten äußeren Haarzellen Schritt für Schritt beschrieben.

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

Der Zebrabärbling ist ein Modell, das hat viele wertvolle Eigenschaften einschließlich optischen Klarheit, schnelle externe Entwicklung und von besonderer Bedeutung auf dem Gebiet der Gehör und Gleichgewicht befindet sich extern sensorischen Haarzellen. Dieser Artikel beschreibt wie transgene Zebrafisch Haarzelle Mechanosensation und präsynaptischen Funktion in toto assay genutzt werden.

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Hier stellen wir ein Protokoll für die Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM) vor, eine berührungslose Scanning-Sondentechnik, die die nanoskalige Abbildung von Stereozilienbündeln in lebenden auditiven Haarzellen ermöglicht.

Stereozilien-Bündelbildgebung mit nanoskaliger Auflösung in lebenden Säugetier-Hörhaarzellen

Erfahren Sie eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Motilität äußerer Haarzellen mit elektrischer Wechselfeldstimulation und Hochgeschwindigkeitsbildanalyse. Diese Technik ermöglicht präzise Einblicke in die Cochlea-Funktion und Hörforschung.

Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis (Video) | JoVE Journal

Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis

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