Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Bewegungsreaktionen äußerer Haarzellen oder OHCs vorzustellen, einschließlich Elektromotilität, langsamer Motilität und Verbiegung bei akustischen Frequenzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Schläfenbeine von Meerschweinchen, Mäusen oder anderen Säugetieren entnommen und die Paukenhöhle geöffnet werden, um das Cochlea freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, das Cochlea in Lebovits L 15 einzutauchen, den apikalen Bereich der knöchernen Hülle, das Spiralband und das Stria vascularis zu entfernen und das Corti-Organ zu isolieren.

Nach einer fünfminütigen Inkubation des Corti-Organs in Kollagenase (1 Milligramm pro Milliliter) wird es mit einer 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze in die Aufzeichnungskammer überführt, und die Zellen werden durch Rückführung durch die Nadel dissoziiert. Anschließend wird die Aufzeichnungskammer unter das Mikroskop gebracht, um die Zellen mit einem äußeren, wechselnden elektrischen Feld zu stimulieren und die beweglichen Reaktionen isolierter äußerer Haarzellen mittels einer Hochgeschwindigkeitskamera aufzuzeichnen. Letztendlich können äußere Haarzellen, Elektromotilität, langsame Motilität und Verbiegung bei akustischen Frequenzen durch computerunterstützte Bildanalyse ausgewertet werden.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Schläfenbeine von Meerschweinchen, Mäusen oder anderen säugetierischen Tiermodellen entnehmen. Öffnen Sie anschließend die Schläfenbeine mit einer Auls-Zange. Um das Cochlea freizulegen, entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Knochenmaterial, wobei die knöcherne Hülle des Cochlea intakt bleiben muss, und tauchen Sie es in Livi L 15 ein.

Öffnen Sie unter dem Mikroskop den apikalen Bereich der Cochlea. Entfernen Sie den Trockner, die VASIs und das Spiralband mit der Spitze einer Skalpellklinge, einem Mikropunkt-Pick oder einer feinen Pinzette. Entfernen Sie das Corti-Organ mit der Pinzette aus der Cochleamodiolus.

Als Nächstes geben Sie das Cochlea in eine Lösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Falls Haarzellen aus den basalen Windungen des Cochlea benötigt werden, entfernen Sie die knöcherne Hülle, die die Basis des Cochlea bedeckt, mit dem Präparationsbesteck und lösen Sie die Spirale mit der Skalpellklinge vom Schläfenbein. Bevor Sie das Corti-Organ entfernen, überführen Sie das Corti-Organ mit einer 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze in die Aufnahmekammer. Anschließend dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie sie mehrfach durch die Nadel der Spritze ziehen.

Hier ist das Diagramm des externen Wechselstrom-Elektrikfeldgenerators und der Verbindungen zum Bildaufnahmesystem, der Steuerschaltung und der Software, die speziell im technischen Kern des House Ear Institute implementiert wurde. Der im Experiment verwendete Versuchsaufbau besteht aus einem umgekehrten Axia vert 1 3 5 TV-Mikroskop mit einem alternativen, LED-basierten Beleuchtungssystem und zwei elektronischen Mikromanipulatoren. Am Mikroskop sind drei Kameraanschlüsse vorhanden: Eine PC-gesteuerte ultraschnelle Photron Fastcam PCI-Kamera mit 1024 × 1024 Pixel Auflösung im Teleport, die Bilder mit hohen Frequenzen bis zu 100.000 Bildern pro Sekunde (FPS) aufnimmt.

Die Bilder, die von der Hochgeschwindigkeitskamera bereitgestellt werden, werden direkt auf dem PC-Monitor beobachtet. Eine zusätzliche reguläre CCD-Kamera am Okularanschluss ist mit einem hochauflösenden Monitor verbunden. Eine herkömmliche digitale Foto-Kamera am Frontanschluss ermöglicht die Aufnahme von Standbildern. Eine hausgemachte Software, die auf demselben PC läuft, steuert den Auslöser der Hochgeschwindigkeitskamera, das Beleuchtungssystem und die externe montierte Wechselstrom-Elektrode.

Die beiden Elektroden bestehen aus zwei Silberdrähten mit einem Durchmesser von 0,25 Millimetern und einem Spitzenabstand von 0,8 Millimetern an einem elektrischen Mikromanipulator. Kalibrieren Sie anschließend das elektrische Feld mithilfe einer externen Elektrode. Diese Elektrode misst das elektrische Potential an verschiedenen Punkten und erzeugt so eine Karte des elektrischen Feldes.

Wenn eine einzelne isolierte äußere Haarzelle zwischen die Spitzen der Elektroden platziert wird, wobei ihre Längsachse parallel zum angelegten wechselnden elektrischen Feld ausgerichtet ist, bewegt sie sich, indem sie sich mit derselben Frequenz wie das elektrische Feld verlängert und verkürzt. Beispielsweise wird hier eine Zelle dargestellt, die mit 50 Hertz stimuliert und mit 1000 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet wird. Dieses nächste Bild zeigt eine Zelle, die mit vier Kilohertz stimuliert und mit 18.000 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet wird.

Wenn die Zelle senkrecht zum Feld platziert wird, kann eine andere Art der Biegungsreaktion der äußeren Haarzellen beobachtet und untersucht werden. Diese Zelle beispielsweise verbiegt sich, wenn sie mit einem elektrischen Feld senkrecht zu ihrer längeren Achse bei 50 Hertz stimuliert wird. Äußere Haarzellen können Formänderungen als Reaktion auf nichtelektrische Reize zeigen.

Diese Reaktion wird als langsame Motilität bezeichnet und kann ebenfalls mit dieser Technik untersucht werden. Wählen Sie unterschiedliche Stimulationsarten aus den vier verschiedenen Protokollen aus. Das erste ist die kontinuierliche Einzelfrequenz.

Beachten Sie, dass der Stimulationsmodus, die Frequenz, die Amplitude und der Wellentyp ausgewählt werden können, was durch rote Kreise mit der selbstgebauten Steuerungssoftware angezeigt wird. Das zweite Stimulationsprotokoll ist die gebündelte Einzelfrequenz, bei der die Länge der Pulse und die Pausen zwischen den Pulsen einstellbar sind. Das dritte ist der lineare Frequenzsweep, bei dem die Anfangs- und Endfrequenzen justierbar sind.

Das vierte Stimulationsprotokoll ist die Multistimulation, die es ermöglicht, verschiedene Stimulationsmodi zu kombinieren. Nach Auswahl der entsprechenden Parameter konfiguriert die Steuersoftware das System und ermöglicht es dem Bediener, durch Anklicken einer einzigen Schaltfläche auf dem Computerbildschirm eine lichtsynchronisierte Videoaufnahme und Zellstimulation zu starten. In diesem Film sind Veränderungen der Länge oder Krümmung der isolierten äußeren Haarzellen zu sehen, wenn sie mit einem externen, alternierenden elektrischen Feld stimuliert werden, das jeweils parallel oder transversal zu ihrer Längsachse ausgerichtet ist.

Die Antworten der äußeren Haarzellen werden offline mithilfe der Merkmalsverfolgungsfunktion der Pro-Analysts-Software analysiert. Hier ist eine äußere Haarzelle dargestellt, die mit einer Frequenz von 50 Hz stimuliert und mit 1000 Bildern pro Sekunde aufgezeichnet wurde. Die Software liefert den Abstand zwischen zwei Punkten bildweise, wie hier während der Zellverkürzung gezeigt. Der Abstand zwischen den am Zellende ausgewählten Punkten, rot markiert als Cuticulaplatte, und der Zellbasis, grün markiert als basales Pol, ist geringer und nimmt bei Zellverlängerung zu. Die Software führt eine bildweise Analyse der Änderungen in der Länge der äußeren Haarzelle durch.

Das Feld unten im Bild zeigt die Spur der Bewegung. In diesem Beispiel beträgt die gesamte Änderung der Länge etwa 6,5 Pixel. Hier ein Beispiel, das zeigt, dass die Zellkante erkannt werden kann und die Fläche des optischen Schnitts automatisch durch die Konturverfolgungsfunktion mit der Pro-Analys-Software gemessen werden kann.

In diesem Experiment werden Polystyrol-Mikrokügelchen zufällig der Badlösung hinzugefügt und fest an der Plasmamembran angeheftet. Verschiedene Mikrokügelchen können gleichzeitig ausgewählt werden, und die Software kann alle von ihnen Bild für Bild automatisch verfolgen. Auf diese Weise können die Zellen in Abschnitte unterteilt werden, und die Beweglichkeit jedes Abschnitts kann unabhängig voneinander bewertet werden.

Indem man die Mikrokügelchen an den seitlichen Rändern der Zelle auswählt, können Bildänderungen in der Länge jedes Segments sowie Änderungen im Winkel eines Segments gegenüber dem anderen unabhängig voneinander bewertet werden. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden.

Selbstverständlich ist zusätzliche Zeit für die Offline-Analyse der aufgezeichneten Filme erforderlich. Mit geeigneter Software kann diese Analyse jedoch pro Film in etwa drei weiteren Stunden abgeschlossen werden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bewegungsreaktionen äußerer Haarzellen untersucht, einschließlich Elektromotilität, langsamer Motilität und Biegung bei akustischen Frequenzen.