Name: Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen zu funktionalen Hepatozyten mit einer Effizienz von etwa 90 Prozent. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung unerschöpflicher Mengen primärer humaner Leberzellen für die Forschung.

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Dr. Hay von einem RCUK Fellowship unterstützt wurde, Dr. West von der Abteilung für Chirurgie unterstützt wurde, Dr Medine durch einen Zuschuss aus der BHF-Core Fund unterstützt wurde, war Herr Baltasar SHS-Villarin durch eine MRC PhD Studenship unterstützt. Dr. Zhou wurde durch ein Stipendium der chinesischen Regierung unterstützt.

<ol><li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+era+for+hepatology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li>
<li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li>
<li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li>
<li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li>
<li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li>
<li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li>
<li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling%5BTitle%5D)+AND+%22+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine einfache, homogene und reproduzierbare in vitro-Modell, um skalierbare Ebenen der menschlichen HLCs generieren entwickelt. Unser Modell wurde von einer Reihe von externen kooperierenden Laboratorien validiert. Wir routinemäßig charakterisieren Stammzellen abgeleitete HLCs mit unserem Haus in Tool-Box von Entwicklungs-Marker und der Leber spezifischen funktionellen Assays (die meisten davon sind im Handel erhältlich). Die kritischen Phasen in unserem Prozess sind: die Erhaltung von Stammzellen Plu...

Matrigel Beschichtung Platten und Flaschen <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, UK); bei -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Zellkulturplatten (6 gut, 12 gut, Corning, UK) </li><li> Zellkulturflasche (25 cm2 entlüftet, Corning, UK) </li></ol> hESC Wartung <ol><li> Maus embryonale Fibroblasten-konditioniertem Medium (MEF-CM) (100 mL, R &amp; D Systems, USA); bei -20 ° C. </li><li> BSA-Lösung (50 ml, Sigma Aldrich, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Menschliche basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (100 ug, PeproTech, USA); bei -20 ° C. </li></ol> Die Passage hESCs mit Kollagenase <ol><li> Confluent gut oder Flasche hESCs. </li><li> Matrigel beschichteten Vertiefungen oder Flaschen als angemessen. </li><li> Phospate Kochsalzlösung (-MgCl 2, CaCl-2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Maus embryonale Fibroblasten-konditioniertem Medium (MEF-CM) (100 mL, R &amp; D Systems, USA). </li><li> Menschliche basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (100 ug, PeproTech, USA). </li></ol> Differenzierung von hES hepatische Entoderm <ol><li> RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> B27 Supplement (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C. </li><li> Activin A (2 pg, PeproTech, USA); bei -20 ° C. </li><li> Rekombinantes Maus Wnt3a (2 g, R &amp; D Systems, USA); bei -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C. </li><li> Nicht-essentielle Aminosäuren (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> β-Mercaptoethanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, UK); bei Raumtemperatur lagern </li><li> Leibovitz L-15 Kulturmedium (500 ml, Sigmein Aldrich, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Tryptosephosphat Brühe (100 ml, Sigma Aldrich, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Fetale Rinderserum, Hitze inaktiviert (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C. </li><li> Hydrocortison 21-hemisuccinat (100 mg, Sigma Aldrich, UK); bei -20 ° C. </li><li> Insulin (Rinderpankreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); bei -20 ° C. </li><li> L-Glutamin (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C. </li><li> Ascorbinsäure (25 g, Sigma Aldrich, UK); bei -20 ° C. </li><li> Menschliche HGF (10 ug, PeproTech, USA); bei -20 ° C. </li><li> Rekombinantem humanem Oncostatin M (OSM) (50 pg, R &amp; D Systems, USA); bei -20 ° C. </li><li> Spritze getrieben Filtereinheit 0,22 um (Millipore, UK) </li></ol> Charakterisierung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Leber Endoderm Immunfärbung <ol><li> Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung (-MgCl 2, CaCl-2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); store bei Raumtemperatur. </li><li> PBST, PBS aufgefüllt mit 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich, UK). </li><li> Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) wird in PBS hergestellt, speichern -20 ° C. </li><li> Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Ethanol </li><li> Serum (AbD Serotech, UK), bei -20 ° C. </li><li> Sekundäre Antikörper, Alexa-Fluorophore (Molecular Probes, Invitrogen, UK). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) ist in Tris HCL und Glycerin als je Anweisungen des Herstellers hergestellt. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) ist die MOWIOL Lösung in einer 1:1000 verdünnt. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Primärantikörper </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antigen * </td><td> Typ </td><td> Lieferant </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-Cadherin </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-Fetoprotein </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Sekundärantikörper </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-FITC-Konjugat </td><td> Goat Monoklonale </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Die Antikörper für hESC abgeleitet Leber Entoderm Immunfärbung verwendet, verwendet die Konzentrationen der Spezies in der Firmen entwickelt sie aus gekauft. Funktionelle Analyse von Leber-und Endoderm Normalisation (pro mg Protein) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits und Luminometer (Promega, USA). </li><li value="1"> Weiß Flachboden 96 well Assay-Platte (BD Biosciences, UK). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). </li><li> Transparente 96-Well-Assay-Platte (IWAKI, UK) </li></ol>

robuste generierung von leber-ähnlichen zellen aus humanen embryonalen stammzell-populationen

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Trotz der Fortschritte in der Modellierung menschlichen Medikamententoxizität scheitern viele Verbindungen in klinischen Studien wegen unvorhergesehener Nebenwirkungen. Die Kosten für klinische Studien sind erheblich, deshalb ist es wichtig, dass mehr prädiktiven Toxikologie Bildschirme entwickelt und frühzeitig in der Medikamentenentwicklung (Greenhough et al 2010) eingesetzt. Humane Hepatozyten stellen den aktuellen Gold-Standard-Modell für die Bewertung Medikamententoxizität, sondern sind eine begrenzte Ressource, die variable Funktion aufweisen. Daher sind die Verwendung von immortalisierten Zelllinien und tierischem Gewebe Modellen routinemäßig eingesetzt wegen ihrer Fülle. Während beide Quellen informative sind, werden sie durch eine schlechte Funktion, Arten Variabilität und / oder Instabilität in Kultur (Dalgetty et al 2009) begrenzt. Pluripotenten Stammzellen (PSCs) sind eine attraktive Alternative Quelle für humane Hepatozyten ähnlichen Zellen (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs sind in der Lage sich selbst erneuern und sich für alle somatischen Zelltypen des erwachsenen gefunden und stellen dabeieine potenziell unerschöpfliche Quelle von differenzierten Zellen. Wir haben ein Verfahren, das einfache, sehr effiziente, Automatisierung zugänglich und liefert funktionelle menschliche HLCs (; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 und Hay et al 2011 Hay et al 2008) entwickelt. Wir glauben, dass unsere Technologie, um das skalierbare Produktion von HLCs für die Wirkstoffforschung, Krankheit Modellierung, den Bau der extrakorporalen Geräten und möglicherweise zellbasierten Transplantation Therapien führen.

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, homogene Mengen an menschlichen Hepatozyten zu erzeugen, um die Biologie der menschlichen Leber in vitro zu untersuchen. Dies wird initiiert, indem humane embryonale Stammzellen oder humane ES-Zellen unter Verwendung physiologischer Reize, die in A und WINT aktiv sind, zum endgültigen Endoderm getrieben werden A.As in einem zweiten Schritt wird das definitive Endoderm hocheffizient zum hepatischen Endoderm getrieben. Als nächstes wird das humane ESC-abgeleitete hepatische Endoderm in vitro gereift, um funktionsfähige humane Hepatozyten herzustellen.Ergebnisse von PCR-Western-Blotting, Immunfluoreszenz, Eliza-Metabolismus und Arzneimittelmetabolismus deuten darauf hin, dass bei dieser Methode Hepatozyten mit einer Effizienz von etwa 90 % aus menschlichen ES-Zellen gewonnen werden. Mit dieser Technik können wir theoretisch unerschöpfliche Vorräte an primären menschlichen Hepatozyten erzeugen, die ein beträchtliches Maß an menschlicher Leberfunktion aufweisen. In Zukunft wird dies die genaue Vorhersage der Toxizität von Arzneimitteln erleichtern und die menschliche Leber unterstützen. Der Trick besteht darin, die solare Differen

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel wird auf die Entwicklung von Polymer-beschichteten Oberflächen für die langfristige Ausrichtung, stabile Kultur der Stammzell abgeleitet humanen Hepatozyten.

Stabilisierung Leberzell Phänotyp mit optimierten Surfaces

Die hier vorgestellte Methode beschreibt eine skalierbare und gute Herstellungspraxis (GMP) -fähigen Differenzierungssystem menschlichen Hepatozyten-ähnliche Zellen aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen. Es dient als eine kostengünstige und standardisiertes System humanen Hepatocyten-artigen Zellen für Grundlagen- und angewandten Forschung der menschlichen Leber zu erzeugen.

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Ansatz um Hepatozyten-wie Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem 96-well-Plattenformat zu produzieren. Dieser Prozess ist schnell und kostengünstig, so dass die Herstellung von hochwertigen Chargen von Hepatozyten-ähnliche Zellen für Grundlagen- und angewandte Forschung am Menschen versichert.

Halbautomatische Herstellung von Hepatozyten wie Zellen aus pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine monolayer, serumfreie Methode zur effizienten Erzeugung von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in 18 Tagen. Dies beinhaltet sechs Schritte, da hPSCs sequenziell in zwischengeschaltete Zelltypen wie den Primitivstreifen, das definitive Endoderm, das hintere Vorgut und die Leberknospenvorläufer differenzieren, bevor hepatozytenähnliche Zellen gebildet werden.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Herstellung von Hepatosphären aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Kultursystems und einer Zellselbstmontage. Dieses Protokoll ist in einer Reihe von Zelllinien reproduzierbar, kostengünstig und ermöglicht die Produktion von stabilen menschlichen Hepatosphären für die biomedizinische Anwendung.

Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

Das Ziel dieses Artikels ist es, einen standardisierten Ansatz zur Induktion der Differenzierung des menschlichen Lebervorläufers von pluripotenten Stammzellen bereitzustellen. Die Entwicklung dieses Verfahrens mit gebrauchsfertigen Medienformulierungen bietet dem Anwender ein einfaches System zur Erzeugung menschlicher Leberzellen für die biomedizinische Forschung und Translation.

Hepatischer Vorläufer aus pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Differenzierungssystems

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Hier stellen wir eine nicht-genetische Methode zur Erzeugung humaner autologer Lebersphäroide unter Verwendung mononukleärer Zellen vor, die aus peripherem Blut im stationären Zustand isoliert wurden.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Die verfügbaren Systeme zur Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (PSC) zu funktionellen Zellen werden derzeit durch Probleme mit starker Variabilität von Linie zu Linie und von Charge zu Charge behindert. Hier stellen wir am Beispiel der kardialen Differenzierung ein Protokoll vor, um den Prozess der PSC-Differenzierung auf Basis von bildbasiertem maschinellem Lernen intelligent zu überwachen und zu modulieren.

Eine auf Lebendzellen basierende Strategie für maschinelles Lernen zur Überwachung der Differenzierung pluripotenter Stammzellen

Erfahren Sie die effiziente Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen zu funktionalen Hepatozyten mit einer Effizienz von etwa 90 Prozent. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung unerschöpflicher Mengen primärer humaner Leberzellen für die Forschung.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

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