JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 4:13 Min. • April 30th, 2023
Tumorigene Zellen aus dem Eileiter regen gesunde Eierstockzellen dazu an, chemische Kommunikatoren oder kleine Moleküle zu produzieren, die die Tumormetastasierung fördern. Um diese chemischen Kommunikatoren zu visualisieren, beginnen Sie damit, einen Well-Divider auf einem geeigneten Objektträger zu montieren. Positionieren Sie eine Kunststofftrennwand diagonal in der Vertiefung, um die Vertiefung in zwei gleich große Fächer zu unterteilen. Geben Sie eine Suspension von Eileitertumorzellen in flüssiger Agarose in ein Kompartiment der Vertiefung ab. Beim Abkühlen verfestigt sich die Agarose und bildet ein 3D-Netzwerk, das den Einschluss von Tumorzellen ermöglicht.
Entfernen Sie die Trennwand und legen Sie ein gesundes Eierstockgewebe mittig in das leere Fach. Bedecken Sie es mit einer flüssigen Agarosemischung. Lassen Sie die Agarose sich verfestigen und betten Sie das Eierstockgewebe in der Nähe der Krebszellen ein. Inkubieren Sie für die gewünschte Dauer. Sowohl die Tumorzellen als auch gesunde Eierstockzellen produzieren kleine Moleküle, die durch das Agarose-Netzwerk zu ihren Nachbarzellen diffundieren.
Entfernen Sie den Grubenteiler. Trocknen Sie die Co-Kultur, um den Agar zu trocknen und zu glätten, und fangen Sie die freigesetzten kleinen Moleküle in der Matrix ein. Visualisieren Sie die Verteilung kleiner Moleküle mit Hilfe der bildgebenden Massenspektroskopie (IMS).
Platzieren Sie den 8-Well-Teiler auf dem ITO-behandelten Objektträger und setzen Sie die Kunststoffteiler diagonal in die Vertiefungen ein. Bereiten Sie Zellkulturen wie bisher vor und kombinieren Sie 100 Mikroliter Zellsuspension und 100 Mikroliter verflüssigte Agarose in einem 2-Milliliter-Röhrchen. Sofort 150 Mikroliter Zell-Agarose-Mischung auf eine Seite des Teilers auffüllen, während der Druck nach unten auf den Teiler ausgeübt wird.
Agarose ca. 1 Minute abkühlen und fest werden lassen und dann den Teiler entfernen. Platzieren Sie das Eierstockexplantat mit einer Pinzette in der Mitte der leeren Hälfte der Vertiefung. Geben Sie 150 Mikroliter Zell-Agarose-Mischung über den Eierstock. Inkubieren Sie den Objektträger bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator.
Entfernen Sie nach vier Tagen den Kammerteiler von den Agarose-Steckern. Lösen Sie mit einem flachen Spachtel die Seiten der Agarose von der Kammer und ziehen Sie die Kammer vorsichtig nach oben. Wenn Agarose-Plugs bewegt werden, positionieren Sie sie vorsichtig so, dass sie sich nicht berühren.
Legen Sie den Objektträger für etwa vier Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Ofen und drehen Sie ihn stündlich um 90 Grad, um eine gleichmäßige Wärmeverteilung in der Probe zu gewährleisten. Die Rutsche muss vollständig getrocknet sein; Andernfalls könnte es zu einer Explosion der Probe im Hochvakuum des MALDI-TOF-Massenspektrometers kommen.
Das Trocknen des Objektträgers und die Überwachung des Fortschritts ist der wichtigste Schritt, um eine hohe räumliche Auflösung und Qualität der Massenspektren zu erreichen. Wenn Abplatzungen oder übermäßige Faltenbildung auftreten, empfehlen wir nicht, die massenspektrometrischen Daten zu sammeln.
Tragen Sie mit den auf dem Matrixsprühgerät eingestellten Parametern die Matrixlösung auf den Objektträger auf. Um Phosphorrot als Kalibrant zu verwenden, geben Sie 1 Mikroliter Phosphorrot auf eine klare Stelle auf dem Objektträger. Um die Peptidmischung als Kalibrant zu verwenden, mischen Sie sie mit der Matrix auf Parafilm im Verhältnis 1 zu 1, um die Ionisation zu unterstützen, und tupfen Sie 0,5 bis 1 Mikroliter auf den Objektträger. Warten Sie, bis das Kalibrant getrocknet ist, bevor Sie die Massenspektrometrie-Daten erfassen.