Proximales Kultursystem: Eine In-vitro-Kulturtechnik zur Untersuchung der parakrinen Signalübertragung zwischen Zellen

Bei der parakrinen Signalübertragung produzieren und sezernieren Zellen Signalmoleküle, die Reaktionen in benachbarten Zellen hervorrufen. Um die parakrine Signalübertragung nachzuahmen, beginnen Sie mit der Herstellung von Einzelzellsuspensionen von Eierstockkrebszellen und Mesothelzellen in ihrem geeigneten Medium.

Nehmen Sie als Nächstes einen umgekehrten porösen membranösen Einsatz in einer sterilen Kulturschale. Pipettieren Sie die Krebszellsuspension auf die Unterseite der Einsteckmembran, um eine Flüssigkeitskuppel zu bilden. Inkubieren, damit sich die Zellen absetzen und an der Membran anheften können.

Drehen Sie den Einsatz um, um das Medium abzulassen. Übertragen Sie den Einsatz in eine frische Kulturschale mit Wachstumsmedien, um die Krebszellen zu nähren, die an der Unterseite der Membran haften. Geben Sie nun die mesotheliale Zellsuspension in die Einsatzvertiefung. Inkubieren, damit die Zellen an der gegenüberliegenden Seite der Membran haften können, wodurch ein direkter Kontakt zwischen den beiden Zelltypen verhindert wird.

Während der Kultur sezernieren beide Zelltypen Signalfaktoren. Diese Moleküle diffundieren durch die poröse Membran zu den Nachbarzellen. Sie binden an spezifische Zellrezeptoren und induzieren in beiden Zelltypen komplexe Signalkaskaden.

Beginnen Sie damit, die Eierstockkrebszellen für 40 bis 60 Sekunden von einer 80%igen konfluenten Mischung mit 1 Milliliter 0,25% Trypsin zu lösen, gefolgt von der Neutralisierung der Reaktion mit 6 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern frischem vollständigem Wachstumsmedium.

Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf 100.000 Eierstockkrebszellen pro Milliliter vollständiger Wachstumsmediumkonzentration und platzieren Sie drei invertierte, mit Gewebekulturen behandelte Polycarbonat-Membranzellkultureinsätze mit 0,4 Mikrometern Poren pro Versuchsbedingung in einer sterilen Gewebekulturschale geeigneter Größe. Beschriften Sie die Einsätze entsprechend der Versuchsbedingung und pipettieren Sie die Krebszellen vorsichtig in konzentrischen Kreisen, beginnend von der Mitte der Membran nach außen, um eine 800-Mikroliter-Kuppel zu bilden.

Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie die Zellen auf die Unterseite des Einsatzes säen, damit die Kuppel der mediumhaltigen Zellen während der Inkubation nicht von den Rändern des Einsatzes abläuft.

Wenn alle Einsätze ausgesät sind, decken Sie die Schale ab und legen Sie die Einsätze vorsichtig in den Zellkultur-Inkubator. Nach etwa 4 Stunden lösen Sie das HPMC mit 2 Millilitern 0,25% Trypsin für ein bis zwei Minuten, gefolgt von einer Neutralisation der Reaktion mit 12 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium.

Sammeln Sie das HPMC durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern vollständigem Wachstumsmedium zum Zählen. Verdünnen Sie die Zellen auf 300.000 HPMC pro Milliliter vollständiges Wachstumsmedium und geben Sie 2,5 Milliliter frisches vollständiges Wachstumsmedium in jede Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte.

Platzieren Sie jeden Einsatz mit einer sterilen Pinzette mit der rechten Seite nach oben in jede Vertiefung der 6-Well-Platte, so dass die an den unteren Eierstockkrebszellen befestigten Oberflächen in das Medium eintauchen. Säen Sie dann 1,5 Milliliter HPMC in die Vertiefung jedes Einsatzes und legen Sie die Platte für 72 Stunden in den Zellkultur-Inkubator.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).