Modellierung der Metastasierung von Eierstockkrebs in der Peritonealhöhle: Eine Methode zur Erstellung eines In-vitro-3D-Modells der Peritonealschleimhaut

Das Peritoneum oder die Membran, die die Bauchhöhle auskleidet, besteht aus peritonealen Mesothelzellen, die auf einer Schicht aus fibrovaskulärem Bindegewebe getragen werden. Metastasierende Eierstockkrebszellen haften an dieser Bauchfellschleimhaut und vermehren sich zu krebsartigen Wucherungen.

Um die Metastasierung von Eierstockkrebs zu modellieren, beginnen Sie damit, menschliche Fibroblasten in einer konischen Röhre zu nehmen und sie mit Kollagen - einem extrazellulären Matrixprotein - zu mischen. Gib die Suspension auf eine Kulturschale. Inkubieren, um die Verfestigung der Kollagenmatrix zu erleichtern, um die Fibroblasten einzubetten und das Bindegewebe des Peritoneums nachzuahmen.

Fügen Sie als nächstes eine Suspension von Mesothelzellen über die Fibroblasten-Kollagen-Schicht hinzu. Inkubieren Sie die Platte, damit die Mesothelzellen anhaften und eine Monoschicht auf der Oberfläche der Fibroblasten-Kollagen-Schicht bilden können. Diese organotypische 3D-Kultur ahmt nun die Zusammensetzung und Architektur einer in vivo Peritonealauskleidung nach.

Zum Schluss besäen Sie diese organotypische Kultur mit Eierstockkrebszellen und inkubieren Sie sie für die gewünschte Dauer. Die Eierstockkrebszellen setzen bestimmte Signalmoleküle frei, die die Mesothelschicht verändern, die Adhäsion und Invasion von Krebszellen verbessern und in vivo metastasierende Bedingungen nachahmen.

Um die normalen Omentum-Fibroblasten aus der Kultur freizusetzen, spülen Sie den Kulturkolben mit 10 Millilitern PBS, gefolgt von 3 Millilitern Trypsin, nicht länger als 5 Minuten. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit mindestens dem dreifachen Volumen des Vollwachstumsmediums und geben Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern vollem Wachstumsmedium. Zählen Sie dann die Zellen und verdünnen Sie sie auf eine 2 bis 4 mal 10 bis dritte Fibroblastenkonzentration pro 100 Mikroliter voller Wachstumsmedium.

Fügen Sie als Nächstes 0,5 Mikrogramm pro 100 Mikroliter Rattenschwanzkollagen I zu den Zellen hinzu und geben Sie 100 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in eine schwarze, durchsichtige untere 96-Well-Platte. Übertragen Sie dann die Platte für mindestens 4 Stunden in einen Zellkultur-Inkubator oder bis die Zellen an der Plattenoberfläche haften. Während sich die normalen Omentum-Fibroblasten absetzen, lösen Sie das HPMC von ihren Kulturflaschen und verdünnen Sie diese Zellen auf 1 bis 2 mal 10 bis das vierte HPMC pro 50 Mikroliter Vollwachstumsmedium.

Geben Sie dann 50 Mikroliter HPMC pro Vertiefung zu den angehängten normalen Omentum-Fibroblasten und stellen Sie die Platte mindestens 18 Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator, bevor Sie sie experimentell verwenden. Am nächsten Tag säen Sie die organotypischen 3D-Co-Kulturen mit GFP-exprimierenden Eierstockkrebszellen aus einer 80 % bis 90 % konfluenten Kultur in der geeigneten Verdünnung für den gewünschten Downstream-Assay aus.