Mesothelialer Clearance-Assay: Eine in vitro Technik zur Quantifizierung der Invasionsfähigkeit von Eierstockkrebs-Sphäroiden in mesotheliale Zellmonoschichten
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 4:34 Min. • April 30th, 2023
Während der Metastasierung von Eierstockkrebs lösen sich bösartige Zellen von der primären Tumorstelle und beginnen in der Bauchhöhle zu zirkulieren. Diese Zellen können dann Cluster oder Sphäroide bilden, die an der Monoschicht der Mesothelzellen haften, die die Bauchhöhle auskleiden. Wenn der Tumor wächst, beseitigt er die darunter liegenden Mesothelzellen, um die Invasion zu erleichtern.
Um die mesotheliale Clearance zu modellieren, beginnen Sie mit der Aussaat von Mesothelzellen, die grün fluoreszierendes Protein oder GFP exprimieren, in eine mit Fibronektin beschichtete Kulturschale mit Glasboden. Die Fibronektin-Beschichtung sorgt für eine Matrix, die die Zelladhäsion fördert. Inkubieren Sie die Schale, damit sich die Mesothelzellen ausbreiten und eine Monoschicht bilden können.
Übertragen Sie als Nächstes eine Suspension von Eierstockkrebszell-Sphäroiden, die rot fluoreszierendes Protein exprimieren, auf die mesotheliale Monoschicht. Bilde die Kultur über einen längeren Zeitraum mit Hilfe der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie. Die rot fluoreszierenden Sphäroide setzen sich ab und binden sich an die grün fluoreszierende mesotheliale Monoschicht.
Die Krebszellen üben Kraft auf die Mesothelzellen aus, stören die Zellverbindungen und verändern die Integrität der Mesothelschicht. Die Kraft verschiebt auch die darunter liegenden Mesothelzellen, wodurch ein Loch entsteht. Wählen Sie eine geeignete GFP-Filtereinstellung, um das resultierende Loch als schwarzen Bereich im Bild zu visualisieren. Messen Sie den Raum, um das Ausmaß der mesothelialen Clearance zu quantifizieren.
Um diesen Vorgang zu starten, beschichten Sie die Vertiefungen einer MatTek-Schale mit 6-Well-Glasboden mit Fibronektin. Geben Sie 2 Milliliter Fibronektin/PBS-Lösung in jede Vertiefung der Schale und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden Mesothelzellen zur Bildung einer Mesothelzell-Monoschicht werden in 10%igem Basismedium kultiviert. Trypsinisieren Sie eine Platte mit Mesothelzellen und drehen Sie sie drei Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 900 U/min.
Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 % Basismedium. Mit 10% Basismedium auf die gewünschte Konzentration einstellen. Wenn die 30-minütige Fibronektin-Inkubation der MatTek-Schale abgeschlossen ist, waschen Sie die Vertiefungen mit 2 Millilitern PBS. Aspirieren Sie das PBS und die Platte 6 mal 10 bis zu den fünften mesothelialen Zellen pro Vertiefung in jeder Vertiefung der 6-Well-MatTek-Schale. Inkubieren Sie die MatTek-Schale über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Zellkultur-Inkubator, damit sich die Mesothelzellen an der Schale anheften und eine Monoschicht bilden können.
Verwenden Sie eine Pipette, um die Eierstockkrebs-Sphäroide von der 96-Well-Poly-HEMA-beschichteten Platte zu sammeln. Aspirieren Sie das Medium aus einer Vertiefung der 6-Well-MatTek-Schale, die eine mesotheliale Zellmonoschicht enthält. Einmal mit 2 Millilitern PBS waschen. Geben Sie alle Sphäroide aus der 96-Well-Platte in eine Vertiefung der MatTek-Schale. Dies ist ungefähr das Dreifache der Anzahl der Sphäroide, die abgebildet werden, um die Sphäroide zu berücksichtigen, die auf dem Teil der Schüssel landen, der nicht abgebildet werden kann.
Da wir nur ein Sphäroid pro Sichtfeld abbilden wollen, muss eine Aggregation der Sphäroide vermieden werden. Schütteln Sie die Schale vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die Sphäroide gleichmäßig auf der Monoschicht zu verteilen, bevor sie sich ansetzen.
Stellen Sie die MatTek-Schüssel auf den Tisch eines inversen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops, das mindestens acht Stunden lang Zeitrafferaufnahmen durchführen kann. Verwenden Sie einen motorisierten Tisch, um mehrere Positionen in der Schale mit mehreren Sphäroid-Interkalationsereignissen in einem einzigen Experiment abzubilden. Die Sphäroide der Eierstockkrebszellen setzen sich am Boden der Schale ab und heften sich an die Monoschicht der Mesothelzellen. Sammeln Sie GFP-, RFP- und Phasenbilder von mehr als 20 Sphäroid-/Monolayer-Wechselwirkungen alle zehn Minuten für acht Stunden.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Wechselwirkung zwischen Ovarialkarzinom-Sphäroiden und mesothelialen Zellen während der Metastasierung. Die Methodik beinhaltet die Abbildung dieser Wechselwirkungen, um die Mechanismen der mesothelialen Clearance zu verstehen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Krebsforschung
Hintergrund
- Ovarialkarzinomzellen können sich von Primärtumoren ablösen und in der Peritonealhöhle zirkulieren.
- Diese Zellen können Cluster bilden, die an Mesothelzellschichten adhärieren.
- Das Verständnis der Mesothelentslöschung ist entscheidend für Einblicke in die Krebsmetastasierung.
- Zeitrafferaufnahmetechniken werden eingesetzt, um diese zellulären Interaktionen sichtbar zu machen.
Zweck der Studie
- Modellierung des Prozesses der mesothelialen Clearance durch Ovarialkarzinomzellen.
- Quantifizierung des Ausmaßes der Störung der mesothelialen Schicht, verursacht durch kugelige Zellverbände von Krebszellen.
- Nutzung der Fluoreszenzmikroskopie zur Echtzeitbeobachtung von Zellinteraktionen.
Verwendete Methoden
- Mesotheliale Zellen, die GFP exprimieren, werden auf mit Fibronectin beschichteten Schalen kultiviert.
- Ovarialkarzinom-Sphäroide, die RFP exprimieren, werden der mesothelialen Monoschicht hinzugefügt.
- Mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie werden die Wechselwirkungen über einen Zeitraum von acht Stunden aufgezeichnet.
- Die Integrität der Zelljunctions und die mesotheliale Freisetzung werden durch Bildgebung beurteilt.
Hauptergebnisse
- Ovarialkarzinomsphäroide heften sich erfolgreich an die mesotheliale Monoschicht an.
- Die von Krebszellen ausgeübte Kraft stört die Zellkontakte der Mesothelzellen.
- Der Abbau mesothelialer Zellen wird in den Bildern als schwarze Bereiche sichtbar.
- Die Quantifizierung des mesothelialen Abbaus erfolgt durch Bildanalyse.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert Einblicke in das metastatische Verhalten von Ovarialkarzinomzellen.
- Das Verständnis der Mesothelentslöschung könnte therapeutische Strategien beeinflussen.
- Die Zeitraffermikroskopie ist eine wirksame Methode, um Zellinteraktionen in der Krebsforschung zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die quantitative Beurteilung der Invasion von Ovarialkarzinom-Sphäroiden in Mesothel-Einschichtkulturen adressiert einen entscheidenden frühen Schritt der metastatischen Progression und liefert direkte Hinweise für die Validierung von Zielstrukturen sowie die mechanistische Risikominimierung in onkologischen Entwicklungsprojekten. Dieser Test ermöglicht eine inhaltsreiche, reproduzierbare Messung zellulärer Interaktionen, die für die metastatische Streuung relevant sind, und stützt die Vorhersagekraft an der Schnittstelle zwischen Entdeckung und präklinischer Entwicklung. Die Integration quantitativer bildgebender Auswertungen stärkt die Portfolioauswahl und -priorisierung für anti-metastatische therapeutische Ansätze.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung von Mechanismen der metastatischen Invasion in einem kontrollierten, krankheitsrelevanten System.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an Zelladhäsion, Migration und Clearance beteiligt sind.
- Bietet eine mechanistische Risikominimierung, indem der Einfluss genetischer oder pharmakologischer Störungen auf die Invasion quantifiziert wird.
- Unterstützt die Vorhersagegenauigkeit bei der Zielstrukturauswahl für die entwicklung von anti-metastatischen Wirkstoffen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert eine standardisierte, quantitative Testplattform zur Bewertung der Wirkung von Verbindungen auf die Sphäroidinvasion.
- Liefert reproduzierbare, bildbasierte Messgrößen, die für den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen geeignet sind.
- Ermöglicht eine Skalierung für den Einsatz in einem mittleren Durchsatzscreening von Inhibitoren, die metastatische Prozesse gezielt beeinflussen.
- Unterstützt die Übertragbarkeit des Assays und die Wiederverwendung der Plattform in onkologischen Forschungsprogrammen.
Translationale und präklinische Forschung
- Modelliert frühe metastatische Ereignisse mit translationaler Relevanz für das Fortschreiten von Ovarialkarzinomen.
- Stellt die Übereinstimmung zwischen In-vitro-Befunden und präklinischen Modellen für eine kontinuierliche Validierung von Biomarkern und Wirksamkeit sicher.
- Informiert risikoadjustierte Fortschrittsentscheidungen für antimetastatische Kandidaten.
- Ermöglicht eine mechanistische Verbindung zwischen Entdeckungsbiologie und präklinischer Evaluierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Mesothelial-Abbau-Assay ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase eingebettet und ermöglicht die Hypothesenprüfung, Zielvalidierung sowie das frühe Screening von Substanzen zur Hemmung der Metastasierung.
- Entdeckungsbioanalyse: Quantifiziert die Dynamik von Zell-Zell-Wechselwirkungen und die Beteiligung von Signalwegen bei der metastatischen Invasion.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse zur Bewertung von Substanzen und genetischen Störungen.
- Analytik: Bietet bildbasierte Messungen des Mesothelabbaus für robuste statistische Vergleiche.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Mechanismen-Erkenntnisse mit in-vivo-Metastasemodellen, wenn sie im Kontext der Erkrankung betrachtet werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Testplattform für vielfältige onkologische Forschungs- und Entwicklungsinitiativen, die auf Metastasen abzielen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung metastasierungsbezogener Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Fördert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Assays für den Einsatz über verschiedene Programmgebiete hinweg.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffiziente Priorisierung von anti-metastasierenden Strategien.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung und Vorselektion von Onkologie-Assets, die die Metastasenprogression targetieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, Fluoreszenzmikroskopie und quantitativer Bildanalyse.
- Setzt Zugang zu Zeitraffel-Bildgebungssystemen und analytischer Software zur Datenquantifizierung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Durchführung des Assays und der Bildgebungsprotokolle über Teamgrenzen hinweg, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Kann je nach Forschungsschwerpunkt eine Anpassung an verschiedene Krebszelltypen oder Mesothelquellen erfordern.
- Die Durchsatzkapazität und Skalierbarkeit sind durch die Bildgebungskapazität und manuelle Handhabungsschritte begrenzt.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Beurteilung von Eierstockkrebs Sphäroid Bindung und Invasion von Mesothelzellen in Echtzeit
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Spheroid Assay zur TGF-β-induzierte Invasion Measure
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Modellierung der Metastasierung von Eierstockkrebs in der Peritonealhöhle: Eine Methode zur Erstellung eines In-vitro-3D-Modells der Peritonealschleimhaut
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Isolierung von Mesothelzellen: Eine Technik zur Isolierung primärer Mesothelzellen aus menschlichen Omentumgewebeproben
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle
Ähnliche Videos
0 Aufrufe
Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026