Egg Windowing: Eine Methode zum Öffnen befruchteter Hühnereischalen, um das Gefäßsystem der chorioallantoischen Membran freizulegen

In einem befruchteten Hühnerei ist die Chorioallantoismembran (CAM) eine stark vaskularisierte Schicht, die sich unterhalb der inneren Eierschalenmembran befindet. Es unterstützt die Entwicklung des Embryos.

Um ein voll entwickeltes CAM freizulegen, platzieren Sie zunächst einen Egg Candler - eine helle Lichtquelle - gegen die Eierschale, um das Innere des Eies zu visualisieren. Lokalisiere die Luftzelle zwischen der äußeren und inneren Eierschalenmembran und einem markanten verzweigten Gefäßsystem innerhalb der Eizelle. Markieren Sie ihre Positionen extern.

Machen Sie an diesen Stellen kleine kreisförmige Löcher in die Eierschale, um die darunter liegende weiße Schalenmembran freizulegen. Durchstechen Sie die freiliegende Membran vorsichtig an beiden Stellen, ohne das CAM zu stören oder Albumin oder Blutaustritt zu verursachen.

Halten Sie das Ei in Längsrichtung und saugen Sie die Öffnung der natürlichen Luftzelle an, um Luft aus dem Inneren abzusaugen. Durch den entstehenden Unterdruck senkt sich die CAM unter die zweite Apertur ab, wodurch eine künstliche Luftzelle über dem Gefäßnetz entsteht.

Umreißen Sie die versetzte Luftzelle. Schneiden Sie durch die Eierschale, einige Zentimeter innen des Umrisses, ohne die Grenze zwischen Luftzelle und CAM zu stören. Entfernen Sie die eingeschnittene Schale, um ein großes Fenster zu erzeugen, das das darunter liegende CAM und das Gefäßsystem freilegt. Verwenden Sie eine transparente Folie, um das Fenster für lebensfähige Eier abzudichten.

Am 7. oder 8. Entwicklungstag, wenn sich das CAM vollständig entwickelt hat, schalten Sie den Eirotator aus und legen Sie etwa 1 bis 3 Eier in das Eierregal in der Biosicherheitswerkbank. Lege bei ausgeschaltetem Licht eine Eierkerze gegen die Eierschale, um die Position der Luftzelle eines Eies zu identifizieren und zu markieren. Bewege dann den Egg Candler über die Schale, um ein großes Blutgefäßnetzwerk zu finden, und drehe das Ei nach Bedarf.

Ein ideales Gefäßsystem verzweigt sich in der Nähe der Mitte des Eies. Verwenden Sie einen Marker, um das Gefäßsystem zu verfolgen, das für die Implantation verwendet werden soll. Nachdem Sie das Licht in der Haube wieder eingeschaltet haben, bohren Sie mit einem Akku-Rotationswerkzeug, das mit einem Siliziumkarbid-Schleifstein bestückt ist, ein kleines Loch in die Schale direkt über der Mitte der Luftzelle. Wenn der größte Teil der Schale entfernt wurde, aber mit weißer, intakter innerer Membran, bohren Sie ein weiteres kleines Loch, in dem das Gefäßfenster geöffnet wird, wie gerade gezeigt. Wenn das zweite Loch fertig ist, stechen Sie mit einer 18-Gauge-Nadel vorsichtig in die weiße Innenmembran über die Luftzelle und das Gefäßsystem und achten Sie darauf, dass die weiße, innere Membran, aber nicht das CAM, im gesamten Bohrbereich durchbrochen wird.

Wenn das Licht der Haube wieder ausgeschaltet ist, überprüfen Sie mit dem Egg Kerzenleuchter, ob die Luftzelle vom Ende des Eies in den Bereich über dem Gefäßsystem übertragen wurde. Platzieren Sie bei Bedarf einen Vakuumschlauch, der in eine Pipettierhilfe eingeführt wird, um das Loch über der ursprünglichen Luftzelle und üben Sie in kurzen Stößen vorsichtig einen Sog aus, um die Luftzelle zu bewegen. Markieren Sie den Umriss der neuen Position der Luftzelle, etwa 0,5 Zentimeter innerhalb der air-CAM-Grenze, und befestigen Sie ein Stück Packband, das gerade groß genug ist, um das Loch über der neuen Luftzelle abzudecken.

Nachdem Sie die beiden anderen Eier wie gerade gezeigt vorbereitet haben, legen Sie die Eier wieder in den Brutkasten und öffnen Sie alle weiteren Eier für das Experiment in Gruppen von 1 bis 3 wie gezeigt. Wenn alle Eier geöffnet sind, geben Sie 1 bis 3 Eier mit versetzten Luftzellen in den Eierständer in der Biosicherheitswerkbank und schneiden Sie mit einem Akku-Rotationswerkzeug mit einem kreisförmigen Schneidrad eine kleine Linie über die Luftzellengrenze vollständig durch die Zelle, ohne das CAM oder das Gefäßsystem zu stören. Schneiden Sie mit einer gebogenen Schere um die verbleibende Luftzelle herum, um ein Fenster in der Schale zu schaffen und die Lebensfähigkeit des Embryos zu überprüfen.

Lebensfähige Embryonen weisen ein ausgedehntes Gefäßsystem, klares Eiweiß, eine Embryonenbewegung und/oder einen sichtbaren Herzschlag auf. Bei nicht lebensfähigen Embryonen kann die CAM undurchsichtig erscheinen, da nur wenige oder gar keine Gefäße vorhanden sind, und die Embryonen können klein sein oder ohne Bewegung oder Herzschlag vorhanden sein. Ziehen Sie mit einer Semken-Pinzette kleine Wattestücke aus einem sterilen Wattebausch und tupfen Sie die CAM-Oberfläche der lebensfähigen Embryonen vorsichtig ab, um Schalenstaub und Ablagerungen zu entfernen. Decken Sie dann die Schalenöffnung mit einem Viertel Stück 6 x 7 Zentimeter transparenter Folie ab, ohne das CAM zu berühren, und legen Sie die Eier mit dem geöffneten Fenster nach oben in den Brutkasten zurück. Verwende ein Stück Eierregal, die Kante des Eierrotators oder einen anderen geeigneten Gegenstand, um Eier abzustützen, die weiterrollen.