Prostata-Organoid-Assay: Eine auf Matrixgel-Ringen basierende Ex-vivo-Kulturtechnik zur Untersuchung der Differenzierungsfähigkeit von Prostata-Epithelzellen

Das Prostataepithel besteht hauptsächlich aus basalen und luminalen Epithelzellen. Eine Monoschicht aus Basalzellen bildet die äußere Auskleidung der Drüse und unterstützt das Überleben der Leuchtzelle. Umgekehrt kleiden die luminalen Zellen das Lumen aus und sezernieren prostataspezifische Proteine.

Um die Differenzierung des Prostataepithels ex vivo zu untersuchen, beginnen Sie mit einer Suspension von basalen Prostataepithelzellen. Mischen Sie die Suspension mit einer gekühlten Basalmembranmatrix im gewünschten Verhältnis. Pipettieren Sie diese Mischung neben dem Boden der Innenwand einer Zellabweisungs-Kulturplatte. Schwenken Sie die Platte für die Mischung, so dass ein Ring entlang des Umfangs der Vertiefung entsteht.

Inkubieren Sie die Platte, damit sich die Matrix verfestigen kann. Ergänzen Sie die Kultur mit einem bevorzugten Medium. Die Wachstumsfaktoren in den Medien unterstützen die Vermehrung von Basalepithelzellen. Gleichzeitig verhindert die zellabweisende Natur der Kulturschale jegliche Zellanheftung und regt die Zellen an, 3D-Sphäroide innerhalb der Matrix zu bilden.

Im Laufe der Zeit entwickeln die Sphäroide Lumen, die von mehrschichtigem Epithel begrenzt sind. Die lumenauskleidenden basalen Epithelzellen differenzieren sich schließlich und bilden sekretorische luminale Zellen, wodurch 3D-Drüsenstrukturen entstehen.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Präparation von basalen und luminalen Prostataepithelzellen der Maus, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern organoiden Mausmedien. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet bei einer Zelldichte von 1.000 Zellen pro Mikroliter. Um Mastermixe herzustellen, mischen Sie Epithelzellen, die in Maus-Organoidmedien suspendiert sind, mit Matrixgel, um eine endgültige Mischung zu erzeugen, die 25 % Zellen in Medien und 75 % Matrixgel enthält. Je nach Downstream-Anwendung werden Basalzellen typischerweise mit einer Konzentration von 100 bis 2.000 Zellen pro 80 Mikroliter plattiert, während Luminalzellen mit einer Konzentration von 2.000 bis 10.000 Zellen pro 80 Mikroliter plattiert werden.

Fügen Sie für jede Zellmischung 80 Mikroliter des Matrixgels pro Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu. Pipettieren Sie einen Tropfen auf die untere Hälfte der Well-Wand und vermeiden Sie dabei den direkten Kontakt mit der Poly-HEMA-Beschichtung. Nachdem Sie das Matrixgel hinzugefügt haben, schwenken Sie die Platte, damit die Matrixgel-Zellmischung einen Ring um den Rand der Vertiefung bilden kann. Legen Sie die 24-Well-Platte mit der rechten Seite nach oben für 10 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen 5%igen CO2-Inkubator, damit das Matrixgel teilweise aushärten kann.

Nach 10-minütiger Inkubation die 24-Well-Platte auf den Kopf stellen und weitere 50 Minuten inkubieren, damit das Matrixgel vollständig aushärten kann. Geben Sie dann 350 Mikroliter vorgewärmtes Maus-Organoid-Medium tropfenweise in die Mitte jeder Vertiefung. Nachdem Sie das Medium hinzugefügt haben, stellen Sie die 24-Well-Platte wieder in den Inkubator.

Um das Organoid-Medium der Maus aufzufüllen, kippen Sie die 24-Well-Platte in einem 45-Grad-Winkel und entfernen Sie das vorhandene Medium vorsichtig mit einer P1000-Pipette aus der Mitte jedes Wells, wobei Sie den Matrix-Gel-Ring vermeiden. Fügen Sie wie zuvor 350 Mikroliter vorgewärmtes Maus-Organoidmedium hinzu. Es wird empfohlen, Organoiden, die länger als fünf Tage kultiviert wurden, ein größeres Medienvolumen zuzusetzen, um eine schnelle Erschöpfung der wichtigsten Nährstoffe und Wachstumsfaktoren zu verhindern.

• Prostate Epithelium - Consists of basal and luminal cells forming the prostate gland's structure.
• Basal Cells - Cells forming the outer lining of the prostate epithelium.
• Luminal Cells - Cells lining the lumen of the prostate gland and secreting prostate-specific proteins.
• 3D Spheroids - Cell structures formed in a cell-repellent environment.
• Organoid Assay - A method to study cell differentiation and formation of 3D glandular structures ex vivo.

• Introduction to Prostate Epithelium - It is formed of basal and luminal cells (e.g., prostate epithelial cells).
• Outline of Cellular Components - Basal cells support luminal cell survival; luminal cells line the lumen (e.g., organoid assay).
• Explanation of 3D Spheroids Formation - Grown within a matrix in a cell-repellent environment.
• Connection to Experiment - Formation of luminal cells from basal cells in 3D glandular structures.

• What are prostate epithelial cells and their role in the prostate epithelium?
• How does the organoid assay contribute to the study of prostatic epithelial differentiation?
• What is the process of 3D spheroids formation in a cell-repellent environment?

• Practical Applications - Used to study cell differentiation and formation of glandular structures ex vivo (e.g., organoid assay).
• Industry Impact - Crucial for biomedical research and development in urology (e.g., prostate health).
• Societal Importance - Contributes to better understanding and treatment of prostate diseases (e.g., prostate cancer).
• Scientific Advancements - Enabled the study of prostate cell proliferation and differentiation.