Proteinlysat-Extraktion: Eine Technik zur Lyse von Organoiden zur Sammlung zellulärer Proteine

Zelllysat, also die Flüssigkeit, die den lysierten Zellinhalt enthält, findet Anwendung in nachgelagerten Prozessen wie Proteinextraktionen und -analysen. Die Untersuchung dieser Fraktionen gibt Aufschluss über die Eigenschaften und Funktionen von Zellen.

Um Organoid-Proteinlysate herzustellen, beginnen Sie mit einer Kultur von Organoiden, die in einer gewünschten Basalmembranmatrix gezüchtet werden. Nehmen Sie das verbrauchte Nährmedium aus der Schale. Geben Sie warme Medien, die Proteasen enthalten, über die Matrix. Wiederholen Sie das Pipettieren, um die Matrize aus der Schale zu lösen.

Inkubiere die Mischung. Die proteolytischen Enzyme im Medium bauen die Matrix ab und geben die Organoide an die Lösung ab. Die Probe wird zentrifugiert, um Organoide von dem enzymhaltigen Überstand zu trennen.

Resuspendieren Sie das Organoid-Pellet in einem geeigneten Proteinlysepuffer. Inkubieren Sie die Probe. Die Detergenzien im Puffer zerstören die Zellmembranen der Organoide und geben intrazelluläre Inhalte an die Lösung ab. Gleichzeitig inaktivieren die Proteininhibitoren im Puffer alle freigesetzten Protease- und Phosphataseenzyme und verhindern so den Abbau ihrer Substratproteine.

Beschallen Sie die Mischung weiter, um die Zellen vollständig zu zerstören. Die Kernhülle reißt auf und setzt Kernproteine in die Lösung frei. Die Schallwellen scheren auch die freigesetzten Nukleinsäuren und verhindern, dass sie das Proteinlysat kontaminieren.

Um Organoide zu sammeln, strahlen Sie das Matrixgel wiederholt, indem Sie 1 Milliliter vorgewärmtes dispasehaltiges Medium direkt auf den Matrixgelring pipettieren, bis sich der gesamte Ring gelöst hat. Übertragen Sie die gelöste Matrix-Gel-Organoidmischung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Nach vollständiger Verdauung, wie im Textprotokoll beschrieben, wird dem Organoid-Pellet phosphatgepufferte Kochsalzlösung zugesetzt und durch leichtes Schnippen resuspendiert.

Die Organoide werden durch Zentrifugation bei 800 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert und der Überstand mit einer Mikropipette entfernt. Resuspendieren Sie die Organoid-Pellets in 100 Mikrolitern Proteinlysepuffer pro 10 Mikroliter gepacktem Zellvolumen. Zum Resuspendieren schnippen. Beschallen Sie nun die Organoide, indem Sie die Röhrchen in nasses Eis tauchen und die Spitze des Schalldismembrators vorsichtig auf die Außenseite des Mikrozentrifugenröhrchens aufbringen. Beschallen Sie 40 Sekunden lang bei 20 kHz, bevor Sie mit dem Western Blotting mit etablierten Protokollen fortfahren.