ADI-basierte Autophagie-Induktion in Prostatakrebszellen: Eine enzymbasierte Technik zur Messung der Autophagiereaktion in Zellen

Autophagie ist ein intrazellulärer Prozess, der den Abbau unerwünschter zytoplasmatischer Komponenten und Organellen in spezialisierten Verdauungskompartimenten, den Lysosomen, erleichtert. Um die Autophagie zu beurteilen, beginnen Sie mit einer adhärenten Kultur von Prostatakrebszellen, die autophagische Markerproteine namens LC3 exprimieren, die an grün fluoreszierende Proteine gekoppelt sind.

Prostatakrebszellen fehlt von Natur aus das Enzym Argininosuccinat-Synthase, das für die Arginin-Aminosäuresynthese notwendig ist. Diese Zellen sind daher für ihr Überleben und ihre Proliferation auf eine externe Arginin-Supplementierung durch Medien angewiesen.

Behandeln Sie anschließend die Zellen mit Arginin-Deiminase oder ADI. ADI hydrolysiert freies Arginin in den Medien, was zu einem Argininmangel führt. In der Folge sind die Zellen metabolischem Stress ausgesetzt, der intern eine autophagische Reaktion auslöst. Behandeln Sie gleichzeitig die Zellen mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff, der Lysosomen in den Zellen markiert.

Während der Autophagie lagern sich becherförmige membranöse Strukturen, sogenannte Phagophore, um die geschädigten zytoplasmatischen Komponenten an. Schließlich dehnen und versiegeln sie ihre Fracht, während sie mit autophagischen Markerproteinen LC3 konjugieren, um doppelmembranige Vesikel oder Autophagosomen zu bilden. LC3-Proteine versorgen die Autophagosomen auch mit fluoreszierenden Markierungen. Die Vesikel verschmelzen dann mit Lysosomen zu Autolysosomen. Lysosomale Proteasen innerhalb der Autolysosomen bauen die verschlungenen zellulären Bestandteile ab.

Beobachten Sie in Echtzeit die helle Fluoreszenz von Autophagosomen und Lysosomen, um deren Verteilung in den Zellen zu bestimmen.

Züchten Sie zunächst menschliche Prostatakrebszellen, die grün fluoreszierende, proteingekoppelte Leichtkette 3 exprimieren, auf 35-Millimeter-Poly-D-Lysin-beschichteten Glasbodenkulturschalen, wie im Textprotokoll beschrieben.

Die Zellen sollten mit ausreichender Dichte plattiert werden, um eine schnelle Proliferation zu ermöglichen, aber nicht so sehr, dass die Zellen zum Zeitpunkt der Bildgebung überwachsen und verklumpt sind. Behandeln Sie ausgewählte Zellproben mit Arginin-Desaminase oder ADI in PBS, um die Zellen von freiem Arginin zu erschöpfen und metabolischen Stress in den Krebszellen zu induzieren.

Verdünnen Sie etwa eine Stunde vor der Bildgebung 1,5 Mikroliter LysoTracker Red mit 20 Millilitern RPMI, die 10 % FBS und 1 % Antibiotika enthalten. Bereiten Sie Lösungen mit ADI für die ausgewählten Proben vor, die behandelt wurden.

Nachdem Sie alle Medien auf 37 Grad Celsius erwärmt haben, geben Sie das entsprechende Medium in jede Kulturschale. Inkubieren Sie Zellen mit RPMI, das LysoTracker Red enthält, für 15 bis 45 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Schalten Sie etwa 30 Minuten vor der Bildgebung das Umgebungsgehäuse der Wetterstation ein und lassen Sie es auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ausgleichen. Waschen Sie die Zellen mit PBS und ersetzen Sie Medien durch Standard-RPMI, die nur 10 % FBS und 1 % Antibiotika enthalten.

ADI wie angegeben zu den Proben hinzufügen. Montieren Sie 35-Millimeter-Kulturschalen mit Deckglas in einem kundenspezifischen Adapter. Verwenden Sie Immersionsöl für die 60-fache Vergrößerung und das Objektiv mit numerischer Apertur von 1,42 und positionieren Sie die montierte Kulturschale auf dem Mikroskoptisch.

• Autophagy - An intracellular process that degrades unwanted cytoplasmic components.
• Argininosuccinate Synthase - An enzyme absent in prostate cancer cells essential for arginine synthesis.
• Arginine Deiminase (ADI) - Enzyme that hydrolyzes free arginine in media, causing cell stress.
• LC3 Proteins - Autophagic marker proteins that provide fluorescent tags to autophagosomes.
• Lysotracker Red DND-99 - A dye used to label lysosomes within cells during autophagy.

• Introduce Autophagy - A degradative process eliminating unwanted parts in cells (e.g., autophagy video).
• Outline Prostate Cancer Cells - Lacking an enzyme, they depend on external arginine sources (e.g., prostate enzyme).
• Explain Induction of Autophagy - ADI depletes arginine causing autophagy in the cells (e.g., autophagy induction).
• Connect to Experiment - The cells are simultaneously treated with lysotracker red DND-99 (e.g., autophagy dye).

• What is autophagy and how does it relate to prostate cancer cells (include ADI)?
• What are LC3 proteins and their role in autophagy?
• How does Arginine Deiminase initiate an autophagic response in cells?

• Practical Applications - Autophagy serves as a potential target for prostate cancer treatment (e.g., autophagy and prostate cancer).
• Industry Impact - Autophagy research benefits healthcare and pharmaceutical sectors (e.g., prostate cancer enzyme marker).
• Societal Importance - Observing real-time autophagy in cells can inform disease treatments (e.g., autophagy videos).
• Link to Scientific Advancements - Dyes like lysotracker red dnd-99 help visualize cellular processes.