Phosphopeptid-Anreicherung: Eine Antikörper-basierte Immunpräzipitationstechnik zur Trennung spezifischer phosphorylierter Peptide aus komplexen Peptidmischungen

Durch die Phosphorylierung spezifischer Aminosäurereste wie Tyrosin werden Phosphopeptide erzeugt, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung mehrerer zellulärer Signalwege spielen. Ihre Untersuchung ermöglicht die Identifizierung potenzieller Biomarker für die Krebstherapie.

Um Phosphopeptide zu isolieren, beginnen Sie mit einem lyophilisierten Pulver aus gereinigten Peptidverdauen, die aus Krebsgewebe extrahiert wurden. Das Pulver wird in einem geeigneten Puffer resuspendiert, um eine gleichmäßige Peptidsuspension herzustellen. Halten Sie einen neutralen pH-Wert aufrecht, um die Peptidstabilität zu gewährleisten.

Bereiten Sie eine Aufschlämmung vor, die aus Hydrogelkügelchen besteht, die an spezifische Anti-Phosphopeptid-Antikörper im gewünschten Puffer konjugiert sind. Geben Sie die Bead-Aufschlämmung in die Peptidsuspension. Die auf den Kügelchen immobilisierten Antikörper erkennen und binden an ihre spezifischen phosphorylierten Aminosäurereste innerhalb der Phosphopeptide und bilden Komplexe.

Zentrifugieren Sie die Mischung, um die Phosphopeptid-Kügelchen-Komplexe im Pellet zu sammeln. Entfernen Sie den Überstand, der ungebundene Peptide oder unspezifische Phosphopeptide enthält. Geben Sie einen geeigneten Elutionspuffer mit niedrigem pH-Wert zu den Komplexen und inkubieren Sie. Der niedrige pH-Wert schwächt die Wechselwirkung zwischen den Phosphopeptidresten und den Antikörper-Bead-Komplexen, wodurch die Peptide in die Lösung freigesetzt werden.

Füllen Sie die Mischung in eine vormontierte Filterpatrone. Zentrifuge, um die freigesetzten Phosphopeptide in das Sammelröhrchen zu eluieren. Die Probe wird bei erhöhter Temperatur vakuumkonzentriert, um den Puffer zu entfernen und ein konzentriertes Trockengranulat aus reinen Phosphopeptiden zu erhalten.

Resuspendieren Sie das lyophilisierte Pulver mit 0,5 Millilitern eiskaltem Immunpräzipitations- oder IP-Bindungspuffer in jeder Fraktion. Übertragen Sie das 0,5 Milliliter Resuspensionsvolumen aus der zweiten Fraktion in das Röhrchen mit der ersten Fraktion und bewahren Sie die Pipettenspitze auf. Verwenden Sie weitere 0,5 Milliliter IP-Puffer, um jedes Gefriertrocknungsröhrchen zu spülen, bevor Sie den Inhalt in das Kryoröhrchen übertragen. Wiederholen Sie dann die Spülung mit 2 Millilitern IP-Puffer.

Nach der Verwendung von P200 mit einer abgeschnittenen Spitze, um die 0,5 Milligramm pro Milliliter Antikörperbead-Aufschlämmung in das Mikrofuge-Röhrchen zu übertragen, fügen Sie 450 Mikroliter eiskalten IP-Bindungspuffer hinzu, um 50 Mikroliter 4G10-Antikörperbead-Aufschlämmung und 25 Mikroliter 27B10.4-Antikörperbead-Aufschlämmung in einem Mikrofuge-Röhrchen zu waschen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 100 x g und 4 Grad Celsius für 1 Minute. Nach dem Ansaugen des Überstands wird ein Volumen zugegeben, das dem ursprünglichen Slurry des IP-Bindungspuffers entspricht, um die Kügelchen zu resuspendieren. Geben Sie vorgewaschene pY-Kügelchen in die resuspendierte Probenlösung in den Kryoröhrchen mit Schraubverschluss. Inkubieren Sie sie dann über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem durchgehenden Rotator. Bewahren Sie nach dem Abdrehen der Kügelchen den Überstand auf, der zur Anreicherung von pST-Peptiden verwendet wird.

Verwenden Sie anschließend 300 Mikroliter IP-Bindungspuffer, um die Kügelchen zu resuspendieren und in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Schleudern Sie die Proben bei 100 x g und 4 Grad Celsius für 1 Minute herunter. Waschen Sie die Kügelchen dann mit 500 Mikrolitern IP-Bindungspuffer dreimal. Waschen Sie die Kügelchen viermal mit 450 Mikrolitern 25 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,5. Tauchen Sie eine Gelladespitze etwas unter die Perlenoberfläche und saugen Sie den Überstand vollständig an. Geben Sie das vierfache des Perlenvolumens von 0,1 % TFA zu den Perlen.

Mischen Sie sie dann gut und inkubieren Sie das Röhrchen in einem Thermomixer bei 1.000 U/min und 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Übertragen Sie die Resuspension in einen 0,2-Mikrometer-Spin-Filter und zentrifugieren Sie den Filter 1 Minute lang bei 850 x g. Nach dem Überführen der Elution in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung wird das Eluat über Nacht bei 40 Grad Celsius mit einer Heizzeit von 300 Minuten vakuumkonzentriert.