Titandioxid-basierte Anreicherung von Phosphopeptiden: Ein Verfahren zur selektiven Isolierung von Phosphopeptiden aus der Peptidbibliothek

Phosphopeptide sind kurze Aminosäurestrings, die phosphorylierte Serin-, Threonin- oder Tyrosinreste enthalten. Um Phosphopeptide aus einer Peptidmischung zu isolieren, beginnen Sie mit der Einnahme von Titandioxidkügelchen in einem Röhrchen. Äquilibrieren zur Konditionierung der Kügelchen unter Verwendung eines geeigneten angesäuerten Bindungspuffers, der ein Abschreckungsmittel enthält. Geben Sie die gewünschte Konzentration der Peptidmischung in die Bead-Aufschlämmung.

Inkubieren Sie die Mischung unter ständigem Schütteln, um zu verhindern, dass sich die Kügelchen absetzen. Der saure Zustand fördert die Phosphatgruppe der Phosphopeptide, um Koordinatenbindungen mit Titankügelchen zu bilden. Das Quenchmittel im Puffer reduziert jede unspezifische Bindung von nicht-phosphorylierten Peptiden an die Beads, so dass sie in der Suspension verbleiben.

Zentrifugieren Sie, um die Phosphopeptid-gebundenen Kügelchen zu pelletieren, während die nicht phosphorylierten Peptide im Überstand verbleiben. Entsorgen Sie den Überstand. Übertragen Sie die Phosphopeptid-gebundenen Kügelchen in eine vormontierte Spin-Filtersäule. Zentrifuge, um den Bindungspuffer zu entfernen und die Phosphopeptid-konjugierten Kügelchen einzufangen.

Füllen Sie den Filter in ein sauberes Rohr und fügen Sie eine ammoniakhaltige Lösung hinzu. Ammoniak macht die Suspension basisch, wodurch sich die Phosphopeptide von den Kügelchen lösen. Zentrifugieren Sie die Assemblierung, um die ungebundenen Phosphopeptide zu eluieren und zu sammeln. Die Titandioxid-Kügelchen verbleiben in der Filterpatrone. Trocknen Sie die Phosphopeptide, um alle Spuren von Ammoniak zu entfernen.

Konditionieren Sie das Titandioxid zweimal mit 500 Mikrolitern 100% ACN. Konditionieren Sie dann das Titandioxid zweimal mit 500 Mikrolitern 0,2 M Natriumphosphatpuffer, pH 7. Zum Schluss verwenden Sie 300 Mikroliter Äquilibrierungspuffer, um die Kügelchen dreimal zu waschen. Geben Sie 400 Mikroliter 50 % ACN, 0,1 % TFA in das Röhrchen mit geringer Proteinbindung. Fügen Sie dann 84 Mikroliter Milchsäure hinzu.

Übertragen Sie die resuspendierten Phosphopeptide in das Röhrchen mit geringer Proteinbindung und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur mit einem Ende-über-Ende-Rotator für 1 Stunde. Nach dem Pelletieren der Kügelchen werden sie mit 300 Mikrolitern Äquilibrierungspuffer zweimal gewaschen und heruntergeschleudert. Spülen Sie die Kügelchen mit 300 Mikrolitern Spülpuffer zweimal aus. Übertragen Sie sie dann in einen 0,2-Mikrometer-Spin-Filter.

Nach dem Schleudern die Filtereinheit in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen mit geringer Proteinbindung umfüllen und den Inhalt mit 200 Mikrolitern 0,9 % Ammonium in Wasser zweimal eluieren. Nach Überprüfung des pH-Werts wird das Eluat über Nacht bis zur Trockenheit vakuumkonzentriert, um das Ammoniak zu verdampfen.

• Phosphopeptides - Short strings of amino acids that contain phosphorylated residues.
• Titanium Dioxide Beads - Used to isolate phosphopeptides from a peptide mix.
• Peptide Mix - A mixture of peptides used in protein analysis and research.
• Phosphopeptide Enrichment Kits - Toolkits developed for isolating and enriching phosphopeptides.
• TFA Buffer - A solution used to stabilize pH, often used in biochemistry and molecular biology.

• Introduction to Phosphopeptides - Essential constituents in protein analysis and research (e.g., phosphopeptides).
• Usage of Titanium Dioxide Beads - They isolate phosphopeptides from a peptide mix (e.g., titanium phosphate).
• Role of Phosphopeptide Enrichment Kits - Helps isolate and enrich phosphopeptides (e.g., massprep phosphopeptide enrichment kits).
• Connection to Experiment – The process of isolating and enriching phosphopeptides is central to this study.

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• Description of Practical Applications – Isolating phosphopeptides has broad applications in protein analysis and research (e.g., peptide mix).
• Identification of Industry Impact – This process is beneficial in various sectors that heavily rely on biochemistry and molecular biology (e.g., healthcare).
• Highlighting Societal Importance – Having a deeper understanding of protein analysis and research paves the way for biological advancements (e.g., sustainability).
• Link to Scientific Advancements – The innovative techniques used to isolate phosphopeptides helps advance our understanding of proteins.