JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 4:00 Min. • April 30th, 2023
Die Färbung elastischer Fasern hilft bei der Untersuchung der Invasion von Krebszellen über die peritoneale elastische Lamina oder das submesotheliale elastische Gewebe hinaus.
Zu Beginn fügen Sie Kaliumpermanganatlösung zu einem verarbeiteten Gewebeschnitt hinzu, gefolgt von einem Eintauchen in Oxalsäure. Die stark oxidierende Eigenschaft der Kaliumpermanganat-Oxalsäure-Kombination bleicht das natürliche Pigment aus dem Gewebeschnitt, um eine Beeinträchtigung des Färbeprozesses zu verhindern, indem die elastische Fasermorphologie
verdeckt wird.Spülen Sie den Objektträger mit Wasser und Ethanol ab, um Bleichmittelreste zu entfernen. Inkubieren Sie die Probe anschließend in einer Elastinfärbung, die einen Eisen-Hämatoxylin-Komplex enthält. Elastin, die wichtigste elastische Faserkomponente, hat eine starke Affinität zu Eisen-Hämatoxylin-Komplexen.
Waschen Sie den Objektträger mit Ethanol und Wasser, um alle Fleckenreste zu entfernen. Zum Schluss behandeln Sie die Probe mit einer Gegenfärbung, die Pikrinsäure und Ponceau S enthält. Die kleineren Pikrinsäuremoleküle dringen in alle Gewebetypen ein, werden aber von den eng strukturierten Muskel- und Krebszellen fest zurückgehalten. Im Gegensatz dazu verdrängen die größeren Ponceau S-Moleküle die Pikrinsäure im porös strukturierten Kollagen, wodurch Kollagen anders gefärbt wird als die Muskel- und Krebszellen.
Unter dem Mikroskop erscheinen elastische Fasern als blau-schwarze Filamente. Kollagen färbt sich rot, während Muskel- und Krebszellen gelb erscheinen. Gelbe Krebszellen, die in die blau-schwarze elastische Lamina eindringen, bestätigen die Metastasierung.
Wischen Sie zunächst mit Seidenpapier überschüssige Lösung auf dem Objektträger oder um das Taschentuch herum ab. Stellen Sie die Objektträger unter Bedingungen auf, die der Raumtemperatur und der Luftfeuchtigkeit entsprechen. Geben Sie ein paar Tropfen Kaliumpermanganat zu jedem Objektträger, um sie zu oxidieren, und stellen Sie sicher, dass das hinzugefügte Volumen ausreicht, um den Gewebeabschnitt auf jedem Objektträger zu bedecken. Spülen Sie die oxidierten Objektträger nach 5 Minuten mit destilliertem Wasser in Coplin-Gläsern ab, wiederholen Sie die Spülung zwei- bis dreimal und verwenden Sie bei jeder Spülung ein neues Glas Wasser. Das Gewebe sollte eine beobachtbare braune Farbe haben.
Geben Sie nun ein paar Tropfen Oxalsäure zu jedem Objektträger, um sie zu bleichen, und stellen Sie sicher, dass das hinzugefügte Volumen ausreicht, um den Gewebeabschnitt auf jedem Objektträger zu bedecken. Spülen Sie die Bleichmittelträger nach 5 Minuten mit destilliertem Wasser aus, wiederholen Sie das Spülen zwei- bis dreimal und verwenden Sie für jede Spülung ein neues Glas Wasser. Waschen Sie die Slides kurz in 95% Alkohol.
Tauchen Sie die gewaschenen Objektträger 8 bis 24 Stunden lang in Elastinlösung. Tauchen Sie die Objektträger dann 1 bis 2 Minuten lang direkt in 95%iges Ethanol, um jeden Gewebeschnitt gut zu differenzieren. Spülen Sie die Objektträger vollständig mit destilliertem Wasser ab.
Mikroskopisch auf die blau-schwarzen elastischen Fasern und den grauen Hintergrund prüfen. Es ist besser, das Gewebe etwas zu unterdifferenzieren, da die anschließende Van Gieson-Gegenfärbung den elastischen Fleck auch etwas entfernen kann.
Färben Sie die Objektträger 1 Minute lang in einer Van-Gieson-Lösung gegen, wobei Sie darauf achten sollten, dass das verwendete Volumen ausreicht, um den Gewebeabschnitt auf jedem Objektträger vollständig zu bedecken. Geben Sie anschließend einige Sekunden lang schnell 95 % Ethanol auf die Gewebescheiben, um jeden Gewebeabschnitt gut zu unterscheiden.