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Unter pathologischen Bedingungen wie Krebs setzen aktivierte Neutrophile extrazelluläre Fallen oder NETs frei - ein Geflecht aus extrazellulärer DNA mit assoziierten Enzymen und antimikrobiellen Proteinen -, die zirkulierende Krebszellen einschließen.
Um die adhäsive Interaktion zwischen NETs und Tumorzellen in vitro sichtbar zu machen, beginnen Sie mit der Kultivierung von Neutrophilen niedriger Dichte, einem Neutrophilen-Subtyp, in einer polymerbeschichteten Kulturschale, die die Zellanhaftung fördert. Inkubieren Sie einige Stunden lang, um die Neutrophilen zur Bildung netzartiger NETs anzuregen.
Geben Sie eine Suspension von roten Fluorescein-markierten Krebszellen in die Neutrophilenkultur. Inkubieren Sie die Krebszellen für einen kurzen Zeitraum mit NETs, um die Interaktion zwischen Krebszellen und -NET zu erleichtern. Die NET-DNA wirkt als chemotaktischer Faktor, der Krebszellen anlockt und ihre Adhäsion an NETs fördert.
Entfernen Sie das verbrauchte Medium. Waschen Sie die Kultur vorsichtig mit einem geeigneten frischen Medium, um alle nicht anhaftenden Tumorzellen aus der Kulturvertiefung zu entfernen.
Fügen Sie nun einen membranundurchlässigen, grün fluoreszierenden Kernfleck hinzu, um die extrazellulären NETs selektiv einzufärben. Beobachten Sie die Kultur unter einem Fluoreszenzmikroskop. Neutrophile extrazelluläre Fallen erscheinen als grüne, fadenförmige Strukturen, die ein Netz bilden, an dem rote Tumorzellen befestigt sind.
Resuspendieren Sie die isolierten Neutrophilen niedriger Dichte bei einer 5 mal 10 bis sechsten Zellen pro Milliliter RPMI 1640 Medium, ergänzt mit FBS-Konzentration, und säen Sie 1 Milliliter Neutrophile pro Vertiefung auf einer 6-Well-Poly-L-Lysin-beschichteten Platte. Nach 2 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid färben Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit einem geeigneten fluoreszierenden membranundurchlässigen Kern- und Chromosomenfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers und beobachten Sie sofort die Morphologie der NETs durch Fluoreszenzmikroskopie.
Um die Adhäsion von Tumorzellen an die NETs zu beurteilen, resuspendieren Sie Magentumorzellen, die mit einem kontrastierenden Fluoreszenzfarbstoff in einem Verhältnis von 1 mal 10 bis zum Sechstel pro Milliliter RPMI 1640 gefärbt wurden, ergänzt mit einer Konzentration von 0,1 % Rinderserumalbumin, und fügen Sie 1 Milliliter Tumorzellen zu jeder Vertiefung der Neutrophilenkulturen mit niedriger Dichte hinzu. Entfernen Sie nach 5 Minuten bei 37 Grad Celsius den Überstand aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Zellen vorsichtig zweimal vorsichtig mit 2 Millilitern vorgewärmtem RPMI 1640 Medium, das mit BSA pro Waschgang versetzt wird.
Eine 5-minütige Inkubation ist lang genug, um NET-spezifische Bindungen zu erkennen. Geben Sie das warme Medium langsam an die Seite jeder Vertiefung, schwenken Sie die Platte vorsichtig und entfernen Sie den Überstand mit einem Aspirator.
Die NETs und die angehängten Tumorzellen können dann mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden.