JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 3:26 Min. • April 30th, 2023
Um eine bestimmte RNA-Sequenz in einer Zelle nachzuweisen, beginnen Sie mit einem Gewebeschnitt auf einem Objektträger. Überlagern Sie den Gewebeschnitt mit einem geeigneten Hybridisierungspuffer, der die Ziel-RNA-Sonden enthält.
Bei diesen Sonden handelt es sich um Z-förmige RNA-Moleküle, die an einem Ende einen Zielerkennungsteil und an einem anderen Ende eine Schwanzsequenz haben. Ein Distanzarm verbindet diese beiden Enden.
Inkubieren Sie den Objektträger nun in einem Hybridisierungsofen bei optimaler Temperatur. Z-förmige RNA-Sonden dringen in die Zelle ein und hybridisieren paarweise mit der entsprechenden Ziel-mRNA-Sequenz
.Nehmen Sie die Schiene aus dem Ofen. Tauchen Sie den Objektträger in eine Waschlösung, um ungebundene Sonden und überschüssigen Hybridisierungspuffer zu entfernen.
Danach eine Vorverstärkerlösung hinzufügen und inkubieren. Das Vorverstärkermolekül bindet an die Schwanzsequenz zweier benachbarter Z-Sonden. Dieses Molekül bindet nicht an eine einzelne Z-Sonde, wodurch die Spezifität gewährleistet wird.
Als nächstes fügen Sie die Verstärker-Reagenz-Mischung hinzu und inkubieren. Mehrere Verstärkermoleküle hybridisieren mit der einzigen Vorverstärkersequenz
.Markieren Sie abschließend den Gewebeschnitt mit den gewünschten Markierungssonden, um das Vorhandensein einer bestimmten RNA-Sequenz in der Zelle nachzuweisen.
Um die Hybridisierung zu starten, klopfen und schnippen Sie auf die Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie wieder in das Objektträgerrack. Nehmen Sie die vorgewärmte HPV-Sonde aus dem Ofen und fügen Sie etwa vier Tropfen hinzu, um jeden Abschnitt vollständig zu bedecken. Decken Sie das Blech mit einem Deckel ab und schieben Sie es für 2 Stunden bei 40 Grad Celsius in den Ofen. Nehmen Sie nach Beendigung der Inkubation das Blech aus dem Ofen und entfernen Sie den Schieberost.
Entfernen Sie einen Objektträger nach dem anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit und legen Sie den Objektträger in ein Objektträgergestell, das in eine mit 1x Waschpuffer gefüllte Färbeschale getaucht ist, waschen Sie die Objektträger 2 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren und wiederholen Sie den Vorgang mit frischem 1x Waschpuffer. Tippen und streichen, um überschüssige Flüssigkeit von den Objektträgern zu entfernen und sie wieder in die Objektträgerablage zu legen. Fügen Sie etwa vier Tropfen AMP1 bei Raumtemperatur pro Abschnitt hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Decken Sie das Blech mit einem Deckel ab und schieben Sie es für 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in den Ofen.
Nachdem Sie das Blech aus dem Ofen genommen haben, entfernen Sie den Schieberost. Arbeiten Sie einen Objektträger nach dem anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit und legen Sie den Objektträger in das Objektträgergestell unter Tauchen in eine mit 1x Waschpuffer gefüllte Färbeschale, waschen Sie ihn 2 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Rühren und wiederholen Sie den Vorgang mit frischem 1x Waschpuffer.