Sondenhybridisierung und Signalamplifikation in RNA in situ Hybridisierung: Eine Technik zum Nachweis spezifischer RNA-Sequenzen in Gewebeschnitten

Um eine bestimmte RNA-Sequenz in einer Zelle nachzuweisen, beginnen Sie mit einem Gewebeschnitt auf einem Objektträger. Überlagern Sie den Gewebeschnitt mit einem geeigneten Hybridisierungspuffer, der die Ziel-RNA-Sonden enthält.

Bei diesen Sonden handelt es sich um Z-förmige RNA-Moleküle, die an einem Ende einen Zielerkennungsteil und an einem anderen Ende eine Schwanzsequenz haben. Ein Distanzarm verbindet diese beiden Enden.

Inkubieren Sie den Objektträger nun in einem Hybridisierungsofen bei optimaler Temperatur. Z-förmige RNA-Sonden dringen in die Zelle ein und hybridisieren paarweise mit der entsprechenden Ziel-mRNA-Sequenz

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Nehmen Sie die Schiene aus dem Ofen. Tauchen Sie den Objektträger in eine Waschlösung, um ungebundene Sonden und überschüssigen Hybridisierungspuffer zu entfernen.

Danach eine Vorverstärkerlösung hinzufügen und inkubieren. Das Vorverstärkermolekül bindet an die Schwanzsequenz zweier benachbarter Z-Sonden. Dieses Molekül bindet nicht an eine einzelne Z-Sonde, wodurch die Spezifität gewährleistet wird.

Als nächstes fügen Sie die Verstärker-Reagenz-Mischung hinzu und inkubieren. Mehrere Verstärkermoleküle hybridisieren mit der einzigen Vorverstärkersequenz

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