Einbettung von 3D-Sphäroiden in Agarose-Geltropfen: Eine Technik zur Konservierung von Sphäroiden für die nachgelagerte Analyse

Sphäroide sind dreidimensionale in vitro sphärische zelluläre Aggregate, die die in vivo Tumormikroumgebung nachahmen und helfen, die Tumorprogression zu untersuchen. Um diese Sphäroide durch Einbetten zu erhalten, beginnen Sie mit der Entnahme eines sterilen Röhrchens mit Sphäroiden in einem gewünschten Puffer.

Behandeln Sie die Sphäroide mit Paraformaldehyd. Paraformaldehyd vernetzt zelluläre Proteine, was zur Stabilisierung und Erhaltung der Zellstruktur führt. Die Sphäroide zentrifugieren und den paraformaldehydhaltigen Überstand entfernen. Suspendieren Sie das Sphäroid-Pellet im Puffer.

Bereiten Sie anschließend die gewünschte Konzentration der geschmolzenen Agarosegellösung vor. Machen Sie einen Agarose-Gel-Tropfen auf einen Objektträger. Halten Sie den Schieber auf einem Heizblock, um eine Verfestigung der Agarose zu vermeiden.

Sammeln Sie mit einer Mikropipette mit einer breiten Blende die Sphäroide aus dem Röhrchen. Pipettieren Sie die Sphäroide vorsichtig in die Mitte des Agarose-Geltropfens, ohne den Objektträger zu berühren. Anschließend wird der Objektträger bei einer geeigneten Temperatur inkubiert, damit sich das ECM verfestigen und die darin enthaltenen Sphäroide einschließen kann.

Übertragen Sie den halbfesten Tropfen vorsichtig vom Objektträger in eine Gewebekassette. Lagern Sie die eingebetteten Sphäroide bis zur weiteren nachgelagerten Analyse in Ethanol.

Befestigen Sie zunächst die Sphäroide am ersten Tag in einem Abzug, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie das Agarose-Gel am zweiten Tag in ein mit Wasser gefülltes Becherglas in der Mikrowelle, um es zu erhitzen, und halten Sie das Gel auf einer auf 60 Grad Celsius eingestellten Heizplatte warm, bis es benötigt wird.

Waschen Sie die Sphäroide zweimal im Abzug mit 1 Milliliter eiskaltem 1X PBS pro Waschgang. Aspirieren Sie dann den größten Teil des PBS. Bereiten Sie eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze vor, indem Sie sie schräg abschneiden, um eine spitzere Spitze mit einem größeren Loch zu erhalten.

Lassen Sie danach einen Agarose-Gel-Tropfen auf einen Objektträger fallen. Legen Sie den Objektträger auf einen warmen Heizblock, um zu verhindern, dass sich die Agarose verfestigt. Mit der modifizierten Pipettenspitze fangen Sie so viele Sphäroide wie möglich in einem Volumen von 15 bis 20 Mikrolitern auf.

Injizieren Sie die Sphäroide vorsichtig in die Mitte des Agarose-Geltropfens und achten Sie darauf, den Objektträger nicht zu berühren. Bei Raumtemperatur oder bei 4 Grad 5 bis 10 Minuten inkubieren, damit der Agarose-Gel-Tropfen aushärten kann. Wenn der Geltropfen etwas erstarrt, aber noch ziemlich weich ist, schiebt man ihn mit einem Skalpell vorsichtig vom Objektträger in eine Plastikkassette. Die Gewebekassette in ein mit Ethanol gefülltes Becherglas umfüllen und bei Raumtemperatur lagern.