Herstellung einer extrazellulären Matrix aus einem Mausmodell: Ein effektives Verfahren zur Herstellung einer dezellularisierten extrazellulären Zungenmatrix aus der Mauszunge

Die extrazelluläre Matrix oder EZM – die nicht-zelluläre Komponente des Gewebemilieus – besteht aus einem komplexen Netzwerk von strukturellen und regulatorischen Proteinen und Polysacchariden, die von Zellen sezerniert werden. Die EZM bietet den Zellen strukturelle und biochemische Unterstützung und reguliert ihr Wachstum.

Um die extrazelluläre Matrix der Zunge vorzubereiten, beginnen Sie mit der Entnahme einer frisch geernteten Mauszunge. Waschen Sie es mit Ethanol, um seine Lipidschicht zu entfernen.

Setzen Sie es dann abwechselnden Gefrier- und Auftauzyklen aus. Das Einfrieren fördert die intrazelluläre Bildung von Eiskristallen, während das Auftauen die Eiskristalle schmilzt, was zu einer Störung der Zellmembran führt.

Hängen Sie nun die Zunge in eine Antibiotikalösung, um das Bakterienwachstum zu hemmen. Behandeln Sie das Organ anschließend mit einer hypertonen Kochsalzlösung. In Gegenwart einer hohen Konzentration an gelösten Stoffen fließt Wasser aus den Zellen heraus, wodurch sie schrumpfen. Dieser Schritt hilft beim Zelltod und bei der Loslösung von der extrazellulären Matrix.

Inkubieren Sie die Zunge in einem nichtionischen Tensid. Das Tensid löst die Zell- und Kernmembranen vollständig auf und erleichtert so die Freisetzung von intrazellulärem Inhalt in die Lösung.

Zum Schluss wird die Zunge in einer Lösung mit Kalzium- und Magnesiumionen aufgehängt, gefolgt von einer Nukleasenbehandlung. Die Calcium- und Magnesiumionen erhöhen die Aktivität der Nukleasen, um freie Nukleinsäuren in der Lösung abzubauen.

Lagern Sie das dezellularisierte Zungengewebe bis zur Weiterverarbeitung in einem geeigneten Puffer.

Nachdem Sie die Zungen von euthanasierten Mäusen gemäß dem Textprotokoll isoliert haben, tauchen Sie das Gewebe 3 Minuten lang in 75%iges Ethanol. Übertragen Sie dann jede Zunge in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 Milliliter 10 Millimolar sterilem PBS. Um die Zelllyse durchzuführen, frieren Sie die Zungen bei minus 80 Grad Celsius für 1 Stunde ein. Tauen Sie dann das Gewebe 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf. Wiederholen Sie das Einfrieren und Auftauen noch zweimal.

Legen Sie anschließend in einer 3,5 Zentimeter oder 6 Zentimeter großen Kulturschale mit 75 % Ethanol jede Zunge mit einer chirurgischen Nadel auf ein Stück chirurgisches Nahtmaterial und umwickeln Sie das Ende der Naht mit einem kleinen Stück steriler Alufolie. Verwenden Sie in einer 3,5 Zentimeter oder 6 Zentimeter großen Kulturschale 3 Milliliter PBS, um jede Zunge 30 Sekunden lang zu spülen. Bereiten Sie dann in einer Weithalsflasche 90 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in 250 Milliliter sterilem Reinstwasser vor und fügen Sie einen Rührstab hinzu.

Senken Sie bis zu 5 Zungen in die Flasche, bis sie etwa 2 Zentimeter vom Boden entfernt sind, und ziehen Sie die Kappe fest, wobei ein Teil der Naht außerhalb der Flasche verbleibt. Stellen Sie die Flasche für 12 Stunden auf einen Magnetrührer. Bereiten Sie dann nach der Inkubation 250 Milliliter 90 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in sterilem 1 molaren Natriumchlorid vor. Übertragen Sie die Zungen und den Rührstab in die Flasche und schrauben Sie den Verschluss auf. Stellen Sie die Flasche für 24 Stunden auf den Magnetrührer.

Um die Zelllyse durchzuführen, bereiten Sie 90 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in 250 Millilitern sterilem 2% Triton X-100 in PBS vor. Übertragen Sie die Zungen und den Rührstab auf die Flasche und ziehen Sie den Verschluss fest. Rühren Sie dann die Flasche 48 Stunden lang um. Nachdem Sie Calciumchlorid und Magnesiumchlorid mit Ampicillin zubereitet haben, bewegen Sie das Gewebe und den Rührstab in die Flasche und rühren Sie die Flasche 24 Stunden lang um.

Bereiten Sie 1 Milliliter 300 mikromolare DNase in HBSS in einem Mikrozentrifugenröhrchen für jede Zungenprobe vor. Übertragen Sie die Zungen in die Röhren, wobei der gleiche Teil der Naht nach außen hängt. Inkubieren Sie das Gewebe dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Proben zurück in eine Weithalsflasche mit sterilem PBS mit Ampicillin und legen Sie sie für 24 Stunden auf den Rührer. Lagern Sie nach der Inkubation die vorbereitete extrazelluläre Zungenmatrix (TEM) bis zur Verwendung in sterilem PBS bei 4 Grad Celsius.