Herstellung der EZM-Suspension: Eine Technik zur Gewinnung einer homogenen Suspension aus einer aus dem Gewebe stammenden extrazellulären Matrix
JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 4:16 Min. • April 30th, 2023
Die extrazelluläre Matrix oder EZM, ein komplexes Stütznetzwerk in Geweben, besteht aus Proteoglykanen und Proteinen.
Um eine homogenisierte EZM zu erhalten, beginnen Sie mit der Einnahme einer abgemessenen Menge dezellularisiertem EZM-Pulver in einem Röhrchen. Geben Sie nun einen angesäuerten Puffer in das Röhrchen, um eine ECM-Suspension zu bilden.
Gleichzeitig lösen Sie in einem anderen Röhrchen Alpha-Amylase - ein glykolytisches Enzym - in demselben angesäuerten Puffer auf. Der saure pH-Wert dieses Puffers ermöglicht die optimale Aktivität des Alpha-Amylase-Enzyms.
Ergänzen Sie anschließend das Röhrchen mit der ECM-Suspension mit einer Alpha-Amylase-Enzymlösung. Inkubieren Sie das Röhrchen unter ständigem Rühren. Alpha-Amylase hydrolysiert die Glykane - die Kohlenhydratgruppen - die in den Proteoglykanen vorhanden sind.
Zentrifugieren Sie, um die proteinreiche EZM-Fraktion zu pelletieren, wobei die verdauten Glykane und verbrauchten Enzyme im Überstand verbleiben. Entsorgen Sie den Überstand.
Das Pellet in Natriumchloridlösung resuspendieren. Die Chlorid-Ionen extrahieren die Proteine aus dem ECM-Pellet in die Suspension. Zentrifugieren und den natriumchloridhaltigen Überstand
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