JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 4:55 Min. • April 30th, 2023
Die perineurale Invasion oder PNI bezieht sich auf die Wanderung von Krebszellen entlang der Nerven und deren anschließende Invasion in das Perineurium - eine geeignete Mikroumgebung für das Wachstum und die Metastasierung von Krebs.
Um PNI in vitro nachzuahmen, beginnen Sie damit, einen Tropfen extrazelluläre Matrix oder EZM-Suspension auf eine Kulturschale zu geben, so dass sie die Form einer Hemisphäre annimmt. Inkubieren Sie nun die Kulturschale, um die strukturellen und funktionalen Merkmale des 3D-Gerüsts zu verstärken.
Platzieren Sie als Nächstes vorsichtig ein vorgeerntetes Spinalganglion oder DRG, eine Ansammlung sensorischer Neuronen, in der Mitte des halbfesten EZM-Tröpfchens. Inkubieren, um das DRG in das ECM-Tröpfchen einzubetten.
Danach ein geeignetes Wachstumsmedium hinzufügen und inkubieren. Die mit Nährstoffen angereicherte ECM begünstigt das Keimen von DRG in kleine Nervenvorsprünge, die Neuriten genannt werden und radial zum Umfang des Tröpfchens herauswachsen.
Entfernen Sie das verbrauchte Medium, um das ECM-Tröpfchen für den nachfolgenden Assay vorzubereiten. Säen Sie fluoreszenzgefärbte adhärente Krebszellen über dem Tröpfchen. Aufgrund der halbkugelförmigen Form rollen Krebszellen um und siedeln sich entlang der Tröpfchenperipherie an.
Inkubieren Sie die Kulturschale, um eine Interaktion zwischen Krebszellen und Neuriten zu ermöglichen. Bei der Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop kann man sehen, wie die Krebszellen entlang der Neuriten folgen und in Richtung DRG wandern, was die perineurale Invasion bestätigt.
Um die halbfesten Matrixtröpfchen herzustellen, wird eine Glasvertiefungsbodenplatte aus dem Eis auf einen Eisblock unter dem Operationsmikroskop übertragen. Setzen Sie die Spitze einer Pipette von nicht mehr als 10 Mikrolitern in einem 45-Grad-Winkel direkt auf das Glas und geben Sie vorsichtig einen 1,5-Mikroliter-Tropfen Matrix auf das Glas. Bewegen Sie die Pipettenspitze langsam vom Glas weg, während die Matrize in die Platte einrastet.
Geben Sie je einen Tropfen Matrix auf jede der vier Ecken der Platte und stellen Sie die Platte für ca. 1 Minute auf eine Oberfläche mit Raumtemperatur. Wenn die Matrize leicht steif geworden ist, legen Sie die Platte wieder auf den Eisblock und schöpfen Sie das DRG mit einer geschlossenen mikroskopischen Pinzette vorsichtig mit der linken Hand auf.
Übertragen Sie mit der rechten Hand vorsichtig das Nervengewebe auf die Spitze einer 21G-Nadel und führen Sie mit der Nadel das DRG vorsichtig in die Mitte des Matrizentröpfchens ein. Der DRG sollte sich leicht in die Matrize lösen lassen, um mit der Nadel zentral positioniert zu werden.
Nachdem Sie in jedes der vier Tröpfchen ein DRG-Stück eingesetzt haben, legen Sie die Platte für 3 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Wenn alle DRG eingebettet sind, halten Sie die Platten nacheinander in einem leichten Winkel und geben Sie langsam 4 Milliliter DMEM mit 10 % FBS auf die Platten, so dass das Medium nur allmählich mit den Matrix-DRG-Einheiten in Kontakt kommt.
Stellen Sie die Platten für weitere 48 bis 72 Stunden in den Inkubator. Wenn die Neuriten mindestens 75 % des Weges bis zum Rand der Matrix erreicht haben, saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen an, ohne die Matrix-DRG-Einheiten zu entfernen. Geben Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette mit einem glatten Auslöser zwei Tropfen von 3 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter Medium auf jeden Matrix-DRG-Assay und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Geben Sie nach einer Stunde vorsichtig 4 Milliliter DMEM mit 10 % FBS entlang der Seitenwand der Glasbodenplatte hinzu und stellen Sie die Platten bis zur nächsten mikroskopischen Auswertung wieder in den Inkubator.