Cancer Side Population Discrimination Assay: Eine Methode zur Isolierung von krebsstammähnlichen Zellen mit dem Hoechst Dye Efflux Assay

Ein Tumor enthält einen kleinen Teil von stammähnlichen Zellen, die als Seitenpopulation bezeichnet werden. Diese Zellen sind chemoresistent und damit für den Krebsrückfall verantwortlich.

Um die Seitenpopulation von Krebszellen zu isolieren, geben Sie zunächst Hoechst - eine fluoreszierende Farbstofflösung - in das Fläschchen mit der Krebszellsuspension. In normalen Krebszellen dringen Hoechst-Moleküle in den Zellkern ein und binden an die A-T-reiche Region in der DNA, was zu einer hohen Fluoreszenz in diesen Zellen führt.

Im Gegensatz dazu enthält die Seitenpopulation eine hohe Konzentration an ABC-Transportern - Effluxpumpen, die die Farbstoffmoleküle schnell aus der Zelle entfernen. Dieser aktive Ausfluss von Farbstoffmolekülen lässt die Seitenpopulation mit geringer Intensität fluoreszieren.

Nehmen Sie nun ein weiteres Fläschchen mit mit Hoechst behandelten Krebszellen und fügen Sie Verapamil hinzu. Dieses Fläschchen dient als Kontrolle, da Verapamil die ABC-Transporter blockiert. Dieser Schritt bewirkt eine Verringerung des Hoechst-Ausflusses und hält den Farbstoff in den Seitenpopulationszellen zurück.

Als nächstes färbst du die Zellen in beiden Fläschchen mit Propidiumiodid gegen. Propidiumiodid dringt ausschließlich in den Zellkern toter Zellen ein und interkaliert zwischen DNA-Basen. Dies führt zu einer hohen Fluoreszenz in den abgestorbenen Zellen.

Sortieren Sie abschließend die Zellen mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer oder FACS. FACS trennt hochfluoreszierende, Hoechst-haltende Tumorzellen und tote Zellen von den niedrig fluoreszierenden Populationszellen.

Um eine Nebenpopulation von Krebsstammzellen mit dem Hoechst-Farbstoff-Efflux-Assay auszuwählen, markieren Sie zunächst ein konisches Röhrchen mit "Hoechst" und eines mit "Hoechst und Verapamil". Als nächstes waschen Sie eine HNSCC-Zellkultur mit sterilem PBS, gefolgt von der Zugabe von 1 Milliliter Trypsin-EDTA. Nach 3 Minuten bei 37 Grad Celsius die Reaktion mit frischem Zellkulturmedium stoppen und die Zellen zählen. Verdünnen Sie die Kultur auf 1 mal 10 bis siebte Zellen pro Milliliter in vollständigem elterlichem Zelllinienmedium.

Geben Sie dann 100 Mikroliter in das Röhrchen "Hoechst und Verapamil" und 4 Milliliter Zellen in das Röhrchen "Hoechst". Mischen Sie anschließend vorsichtig 10 Mikroliter 5 millimolare Verapamilhydrochloridlösung in die Probe von "Hoechst und Verapamil", gefolgt von 5 Mikrolitern Hoechst pro 1 mal 10 zu den sechsten Zellen in beide Röhrchen. Decken Sie dann die Proben mit Alufolie ab und legen Sie sie bei 37 Grad Celsius ab. Nach 90 Minuten mit sanftem Mischen alle 15 Minuten zentrifugieren Sie die Röhrchen und resuspendieren die Pellets in 2 Millilitern PBS.

Nach einer zweiten Zentrifugation wird das Pellet "Hoechst und Verapamil" in 500 Mikrolitern Propidiumiodid in PBS und das Pellet "Hoechst" in 4 Millilitern desselben resuspendiert. Filtern Sie nun die Proben durch 70-Mikron-Zellsiebe in FACS-Röhrchen, um alle Aggregate zu entfernen, und legen Sie die Proben auf lichtgeschütztes Eis. Laden Sie anschließend die "Hoechst"-Probe auf das Durchflusszytometer und öffnen Sie das Fenster "Globales Arbeitsblatt" in der Durchflusszytometer-Software. Klicken Sie auf "Punktdiagramm", um ein Diagramm auf dem globalen Arbeitsblatt zu erstellen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Parameter für die Vorwärts- und Seitenstreuung auszuwählen.

Erstellen Sie auf die gleiche Weise ein seitliches Streudiagramm mit einem Punktdiagramm mit seitlicher Streuhöhe, und klicken Sie dann auf "Polygon-Gate", um im zweiten Diagramm einen P1-Bereich zu erstellen, um die einzelnen Zellen auszuwählen und die Dubletten zu unterscheiden. Erstellen Sie als Nächstes ein rotes Hoechst-Gebiet durch ein blaues Hoechst-Gebiets-Punktdiagramm und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zellen, um die P1-Population hervorzuheben. Erstellen Sie dann einen P2-Bereich, um die negative Hoechst-Farbstoffseitenpopulation von Zellen auszuwählen, die als Seitenarm links von der Hauptpopulation von Zellen angezeigt wird, und erfassen Sie 10.000 der "Hoechst"-Stichprobenereignisse.

Um zu bestätigen, dass das P2-Gate, das die Seitenpopulation darstellt, korrekt positioniert ist, sammeln Sie auch 10.000 "Hoechst und Verapamil"-Beispielereignisse. Die Seitenbevölkerung sollte verschwinden. Sortieren Sie dann die Seitenpopulation der Hoechst-Farbstoff-negativen Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das 1 Milliliter vollständiges krebsstammähnliches Zellmedium enthält. Am Ende der Sortierung schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren das Pellet der Seitenpopulation in 1 Milliliter frischem, vollständigem Krebsstammzellmedium. Zählen Sie dann die Zellen und säen Sie sie in der entsprechenden Anzahl in einen neuen Zellkulturkolben.