Dezellularisierte Zubereitung eines Schweineösophagusgerüsts: Eine Technik zur Erzeugung eines azellulären Gerüsts aus einem Schweineösophagus

Dezellularisierte Gerüste, die aus der extrazellulären Matrix eines bestimmten Gewebes gewonnen werden, ahmen ihre native extrazelluläre Mikroumgebung nach. Diese Gerüste behalten ihre strukturelle Integrität und biochemische Zusammensetzung bei und dienen als vielversprechende Plattformen für das Tissue Engineering.

Um ein dezellularisiertes Schweineösophagusgerüst herzustellen, beginnen Sie mit einem frisch exzidierten Schweineösophagus. Halbieren Sie die Speiseröhre in Längsrichtung und spülen Sie sie mit einem geeigneten Puffer aus, um Ablagerungen zu entfernen. Sichern Sie anschließend die Speiseröhre mit der Schleimhautoberfläche, der innersten Schicht, nach oben.

Trennen Sie die Schleimhaut von der darunterliegenden Submukosa an einem Ende der Speiseröhre. Präparieren Sie die Speiseröhre in Längsrichtung entlang des lockeren Bindegewebes der Schleimhaut, der sogenannten Lamina propria, um die Schleimhautoberfläche vollständig von der darunter liegenden Submukosa zu trennen.

Des Weiteren werden die proximalen und distalen Regionen der Schleimhaut exzidiert, die eine höhere Dichte an submukösen Drüsen und eine dickere Schicht der Lamina propria enthalten. Schneiden Sie das Schleimhautgewebe in gleichmäßig große Stücke.

Behandeln Sie das Gewebe mit einer hypertonen Kochsalzlösung, die mit Antibiotika ergänzt wird. Antibiotika helfen, das Wachstum von Bakterien zu verhindern. Bei einer hohen Konzentration an gelösten Stoffen entweicht Wasser aus den Zellen und bewirkt deren Schrumpfung. Dieser Schritt unterstützt den Zelltod und die Loslösung von der extrazellulären Matrix.

Löse nun das gelöste Epithel vorsichtig vom darunterliegenden Gewebe. Spülen Sie das Gewebe mit Puffer aus, um Zelltrümmer zu entfernen. Zum Schluss wird das Gewebe in Glycerin inkubiert, was die Dezellularisierung des Gewebes weiter erleichtert, indem die Zellen dehydriert und lysiert werden, während die Integrität der Basalmembran erhalten bleibt.

Um die dezellularisierten Schweineösophagusgerüste vorzubereiten, beginnen Sie damit, mit einer Schere und einer Pinzette einen Schweineösophagus in Längsrichtung aufzuschneiden. Waschen Sie anschließend die Speiseröhre in einem sterilen 180-Milliliter-Topf mit 100 Millilitern sterilem PBS für 10 Minuten unter leichtem Schütteln, um Schmutz zu entfernen.

Während das Tuch gespült wird, besprühen Sie ein Kork-Dissektionsbrett mit 70 % Ethanol. Wenn der Korken trocken ist, stecken Sie die Speiseröhre mit der Schleimhautseite nach oben auf das Brett. Fassen Sie nun mit einer sterilen Pinzette die Schleimhautoberfläche an einem Ende der Speiseröhre an und ziehen Sie das Gewebe von der Platte weg, um die Schleimhaut von der darunter liegenden Submukosa zu trennen.

Präparieren Sie dann mit einer sterilen Skalpellklinge die Speiseröhre in Längsrichtung entlang der Lamina propria und entfernen Sie im Laufe der Dissektion die Stifte, damit die Schleimhaut angehoben werden kann. Entsorgen Sie die darunterliegende Submukosa und schneiden Sie die verbleibende Schleimhaut mit einem Skalpell in 5 Zentimeter große quadratische Stücke. Waschen Sie die Stücke in 150 Millilitern sterilem PBS unter leichtem Rühren, wie gerade gezeigt.

Nach fünf Minuten wird das Gewebe in einen 180-Milliliter-Topf mit 150 Millilitern 1 molaren Natriumchloridlösung gegeben, die mit Antibiotika bei 37 Grad Celsius ergänzt wird. Nach 72 Stunden überführen Sie das Gewebe in 150 Milliliter steriles PBS, woraufhin das Epithel begonnen hat, sich sichtbar vom darunter liegenden Gewebe zu lösen.

Verwenden Sie eine sterile Pinzette und eine Skalpellklinge, um das ablösende Epithel zu entfernen, und geben Sie das restliche Gewebe in einen frischen Topf mit 150 Millilitern sterilem PBS mit drei fünfminütigen Wäschen unter sanftem Rühren. Das Gewebe muss nun mindestens vier Monate in Glycerin gelagert werden, um das Gerüst vollständig zu sterilisieren.