Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Herstellungszelllinien für Biologika mit Klonalität und hoher Produktivität zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zuerst die Wirtszelle mit der DNA transeziert wird, die für das interessierende Gen kodiert. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, hochproduktive Klone anhand von Fakten zu isolieren, gefolgt von der Dokumentation der Koloniebildung durch den Klonauswahl-Imager.

Der letzte Schritt besteht darin, hochproduktive Klone zu prüfen und auszuwählen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Antikörperproduktion in kontinuierlichen und gefütterten Chargenkulturen durch Umkehrphasen-HPLC zeigen. Video. Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Tatsache, dass die Sortierung und die pcan 80 dgl-Schritte schwer zu erlernen sind, da bei diesen Verfahren ein komplexer Aufbau erforderlich ist. Die folgenden Wissenschaftler aus einem Labor werden diese Verfahren für die Transfektion des Wirtszelleffekts demonstrieren, die Sortierung von Jason Sanders für die Dokumentation der Koloniebildung und Russell Kan für die Tekanprobenahme.

Und Eliza: Um dieses Verfahren einen Tag vor der Transfektion zu beginnen, säen Sie die Wirtszellen in einem Zellkulturkolben in 15 Milliliter Wachstum. Mittel. Inkubieren Sie die Zellen am Folgetag in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 7,5 % Kohlendioxid, bereiten Sie die Transfektionskomplexe vor, verdünnen Sie zunächst acht Mikrogramm, verdünnen Sie die DNA in 800 Mikrolitern Wachstumsmedium ohne Serum in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es schonend. Verdünnen Sie anschließend 40 Mikroliter Lippe in 800 Mikrolitern Wachstumsmedium ohne Serum in einem Styroporröhrchen.

Fügen Sie die verdünnte DNA zum verdünnten Lipofectamin hinzu. Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Wirtszellen für die Transfektion vorzubereiten. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Zellen und ersetzen Sie es durch 6,4 Milliliter Wachstumsmedium ohne Serum.

1,6 Milliliter der Transfektionskomplexe werden in den Kolben gegeben. Vorsichtig mischen, indem Sie den Kolben schütteln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für sechs Stunden.

Nach sechs Stunden geben Sie acht Milliliter Wachstumsmedium in den Kolben und inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator. Das Medium wird durch Aspiration entfernt und frisches Wachstumsmedium in den Kolben gegeben. Inkubieren Sie die Zellen nach der Inkubation über Nacht erneut.

Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch Selektion. Mittel. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis drei Wochen. Zwei bis drei Wochen nach der Transfizierung sind die Zellen bereit für die Klonierung durch Durchflusszytometrie-aktivierte Zellsortierung, die abgelösten Zellen aus dem Kolben sortiert und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 800 U/min zentrifugiert.

Resuspendieren Sie die Zellen in einem Selektionsmedium, das mit 2 % Rinderserumalbumin ergänzt wird. Fügen Sie dann fluoreszenzmarkierten Anti-Human-IgG-Antikörper hinzu. Fügen Sie eine Verdünnung von eins bis 20 hinzu, inkubieren Sie es 15 bis 30 Minuten lang auf Eis und waschen Sie es dann zweimal mit kalten PBS-Resuspendzellen in einem XPBS in einem Polypropylen-Röhrchen.

Ein Beispiel für gefärbte Zellen ist in diesem Bild für die aseptische Sortierung auf einem BD-Fax zu sehen. Bereiten Sie eine 96-Well-Zellkulturplatte vor, die in jeder Vertiefung 200 Mikroliter Auswahlmedium enthält. Beladen Sie das Röhrchen aseptisch mit Zellen und analysieren Sie die BD-Fakten. Arien die Ergebnisse für gefärbte bzw. ungefärbte Zellen aufzeichnen.

Stellen Sie die Gates und Einstellungen so ein, dass einzelne Zellen des gewünschten Fluoreszenzfärbeprofils in die 96-Well-Platte sortiert werden. Inkubieren Sie die Platte in einem 37-Grad-Inkubator für zwei Wochen am Tag Null, am dritten Tag, am siebten Tag und am 13. Tag nach der Tatsache. Sortieren Sie die Koloniebildung von Dokumenten in der 96-Well-Platte auf einem Klonauswahl-Imager, um die Auswahl von Klonen aus einer einzelnen Zelle für das Screening und die Auswahl für eine hochproduktive Clones. Dokumentieren Sie zunächst die Position der Probe in der empfangenden 96-Well-Assay-Platte. Verwenden Sie dann ein robotergestütztes Liquid-Handling-System, um Aliquots von 20 Mikrolitern Überstand in jede Vertiefung der 96-Well-Assay-Platte zu übertragen. Die Antikörperproduktion in den Proben wird durch ein Sandwich analysiert.

Human IgG erkennt ELI SA auf dem Liquid-Handling-System auf folgende Weise. Zunächst werden die Proben und ein Standard auf vorcodierte Bio-Coat-Anti-Human-IgG-Assay-Platten geladen. Die Platten werden zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von drei PBS-Wäschen.

Next immuno reines Ziegen-Anti-Human-IgG. HRP wird den Platten in einer Verdünnung von 1 bis 2000 zugesetzt und die Platten werden eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Stunde werden die Platten dreimal mit PBS gewaschen und dann das A BTS-Substrat hinzugefügt.

Schließlich werden die Platten auf einem Plattenlesegerät mit einer Absorption von 405 Nanometern zur Detektion rot dargestellt. Unter Verwendung dieser automatisierten Plattform wurde festgestellt, dass der durch die Färbung mit fluoreszenzmarkiertem anti-humanem IgG reflektierte Oberflächenantikörperspiegel mit der Antikörperproduktivität der Zelle korreliert. Wie hier für die beiden besten Klone gezeigt, die aus der Zellpopulation mit hoher Oberflächenantikörperexpression erzeugt wurden, lag die spezifische Produktivität zwischen 50 und 70 Pikogramm pro Zelle und Tag.

Im Gegensatz dazu betrug die Antikörperproduktivität etwa 20 Pikogramm pro Zelle und Tag für die beiden besten Klone, die aus der Zellpopulation mit geringer Oberflächenantikörperexpression erzeugt wurden. Darüber hinaus sind Zelllinien, die durch Faktensortierung entwickelt wurden, stabiler in Bezug auf die Antikörperproduktion als solche, die durch manuelle Verdünnung kloniert wurden. Die spezifische Produktivität des Top-Klon-Klons, der durch manuelle Begrenzung der Verdünnung erzeugt wurde, sank von etwa 30 PCD auf etwa 10 PCD, nachdem 80 Zellverdopplungen kultiviert worden waren.

Auf der anderen Seite konnte der Top-Sub-Klon, der durch die Faxsortierung erzeugt wurde, Klon zwei, die spezifische Produktivität bei etwa 20 PCD für mindestens 100 Zellverdopplungen halten. Die Identifizierung der Transgen-Integrationsstelle im Zellchromosom durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zeigte, dass Klon eins eine gemischte Population von Phänotyp A und Phänotyp ist B.In Gegensatz dazu schien der sortierte Klon mit 99,5% der Zellen des Phänotyps A eine homogenere Population zu sein.Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man produzierende Zelllinien zum Schutz therapeutischer Proteine entwickelt.