Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Herstellungszelllinien für Biopharmazeutika mit Klonalität und hoher Produktivität zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst die Wirtszelle mit DNA transfiert wird, die das Gen von Interesse kodiert. Der nächste Schritt des Verfahrens ist die Isolierung hochproduzierender Klone mittels FACS, gefolgt von der Dokumentation der Koloniebildung durch den Clone Select Imager.

Der letzte Schritt besteht darin, hochproduktive Klone zu screenen und auszuwählen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Antikörperproduktion in kontinuierlichen und fed-batch-Kulturen mittels HPLC in der Umkehrphase zeigen. Video. Die Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte Sortierung und pcan 80 dgl aufgrund des komplexen Aufbaus dieser Verfahren schwer zu erlernen sind. Die folgenden Wissenschaftler aus einem Labor werden diese Verfahren demonstrieren: Transfektion der Wirtszelle durch Effekt, Sortierung durch Jason Sanders zur Dokumentation der Koloniebildung und TECAN-Probenahme durch Russell Kan.

Und Eliza Beginnen Sie dieses Verfahren einen Tag vor der Transfektion, indem Sie die Wirtszellen in einem Zellkulturgefäß mit 15 Millilitern Wachstumsmedium ansäen. Inkubieren Sie die Zellen am folgenden Tag in einem 37 °C warmen Inkubator mit 7,5 % Kohlendioxid. Bereiten Sie am nächsten Tag zunächst die Transfektionskomplexe vor, indem Sie 8 Mikrogramm DNA in 800 Mikroliter Wachstumsmedium ohne Serum in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig verdünnen und mischen. Verdünnen Sie anschließend 40 Mikroliter Lip in 800 Mikroliter Wachstumsmedium ohne Serum in einem Polystyrolröhrchen.

Fügen Sie die verdünnte DNA zu dem verdünnten Lipofectamin hinzu. Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Wirtszellen für die Transfektion vorzubereiten. Entfernen Sie das Wachstumsmedium von den Zellen und ersetzen Sie es durch 6,4 Milliliter Wachstumsmedium ohne Serum.

Geben Sie 1,6 Milliliter der Transfektionskomplexe zu dem Kolben hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Schwenken des Kolbens. Inkubieren Sie die Zellen 6 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator.

Nach sechs Stunden acht Milliliter Wachstumsmedium zum Kolben hinzufügen und am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubieren. Das Medium durch Absaugen entfernen und frisches Wachstumsmedium zum Kolben hinzufügen. Die Zellen nach der Übernacht-Inkubation erneut über Nacht inkubieren.

Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch Selektionsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis drei Wochen. Zwei bis drei Wochen nach der Transfektion sind die Zellen bereit zum Klonen mittels durchflusszytometrischer aktivierter Zellsortierung; lösen Sie die Zellen aus dem Kolben und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten bei 800 U/min und vier Grad Celsius.

Suspendieren Sie die Zellen in Selektionsmedium, ergänzt mit 2 % Rinderserumalbumin. Fügen Sie dann fluoreszenzmarkierten anti-humanen IgG-Antikörper hinzu. Verdünnen Sie im Verhältnis 1:20, inkubieren Sie 15 bis 30 Minuten auf Eis und waschen Sie anschließend zweimal mit kalter PBS-Pufferlösung. Suspendieren Sie die Zellen in einem Volumen XPBS in einem Polypropylenröhrchen.

Ein Beispiel gefärbter Zellen ist auf diesem Bild für die sterile Sortierung auf einem BD FACS Aria dargestellt. Bereiten Sie eine 96-Well-Zellkulturplatte vor, die in jedem Well 200 µL Selektionsmedium enthält. Laden Sie die Zellen aseptisch in die Röhre und analysieren Sie sie am BD FACS Aria. Notieren Sie die Ergebnisse für gefärbte und ungefärbte Zellen jeweils separat.

Stellen Sie die Gates und Einstellungen so ein, dass Einzelzellen mit dem gewünschten fluoreszierenden Färbeprofil in die 96-Well-Platte sortiert werden. Inkubieren Sie die Platte zwei Wochen lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Dokumentieren Sie am Tag null, Tag drei, Tag sieben und Tag 13 nach der Zellsortierung die Koloniebildung in der 96-Well-Platte mithilfe eines Clone Select Imagers, um sicherzustellen, dass Klone aus einer Einzelzelle stammen, und um hochproduktive Klone zu screenen und auszuwählen. Erfassen Sie zunächst die Probenposition in der empfangenden 96-Well-Assayplatte. Verwenden Sie anschließend ein robotergestütztes Flüssigkeitshandling-System, um Aliquots von 20 µL Überstand in jedes Well der 96-Well-Assayplatte zu übertragen. Die Antikörperproduktion in den Proben wird mittels eines Sandwich-ELISA analysiert.

ELISA zur Detektion menschlichen IgG auf dem Flüssigkeitsmanagementsystem wie folgt: Zunächst werden die Proben und ein Standard auf vorkodierte Bio-Coat-Anti-menschliches-IgG-Assayplatten aufgetragen. Die Platten werden zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von drei Waschschritten mit PBS.

Anschließend wird immunschieres Ziegen-Anti-Human-IgG-HRP in einer Verdünnung von 1 zu 2000 zu den Platten gegeben, und die Platten werden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Stunde werden die Platten dreimal mit PBS gewaschen und anschließend das A-BTS-Substrat hinzugefügt.

Schließlich werden die Platten auf einem Plattenreader mit einer Absorption bei 405 Nanometern zur Detektion rot eingefärbt. Mithilfe dieser automatisierten Plattform zeigte sich, dass das durch Färbung mit fluoreszenzmarkiertem anti-humanem IgG ermittelte Oberflächenantikörpelniveau mit der Antikörperproduktivität der Zelle korreliert. Wie hier für die beiden besten Klone dargestellt, die aus der Zellpopulation mit hohem Oberflächenantikörperausdruck hervorgegangen sind, lag die spezifische Produktivität zwischen 50 und 70 Pikogramm pro Zelle pro Tag.

Im Gegensatz dazu betrug die Antikörperproduktivität für die beiden besten Klone, die aus der Zellpopulation mit geringer Oberflächenexpression von Antikörpern hervorgingen, etwa 20 Pikogramm pro Zelle und Tag. Außerdem sind Zelllinien, die durch FACS-Sortierung entwickelt wurden, bezüglich der Antikörperproduktion stabiler als solche, die durch manuelle limitierende Verdünnung geklont wurden. Die spezifische Produktivität des besten Klon, Klon eins, der durch manuelle limitierende Verdünnung erzeugt wurde, sank nach 80 Zellverdopplungen in Kultur von etwa 30 PCD auf etwa 10 PCD.

Andererseits konnte der Top-Subklon, der durch FACS-Sortierung der Klon zwei gewonnen wurde, die spezifische Produktivität über mindestens 100 Zellverdopplungen hinweg bei etwa 20 PCD aufrechterhalten. Die Identifizierung der Transgenintegrationsstelle im Zellchromosom mittels fluoreszierender in-situ-Hybridisierung zeigte, dass Klon eins eine gemischte Population aus Phänotyp A und Phänotyp B darstellt. Im Gegensatz dazu erwies sich der FACS-sortierte Klon als homogenere Population, wobei 99,5 % der Zellen den Phänotyp A aufwiesen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Herstellungszelllinien zur Produktion therapeutischer Proteine entwickelt.