Name: Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Hochdurchsatz-Plattform zur Zelllinienentwicklung für therapeutische Proteine. Diese Methode nutzt Durchflusszytometrie und Bildgebung zur Isolierung hochproduktiver Klone.

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1. Wirtszelle Transfektion <ol><li> Seed 2 x 10 6 CHO-Zellen in T75 DXB11 Corning Zellkulturflasche in 15 ml Wachstumsmedium (MEMA mit Nukleotide und Nukleoside (Gibco, Katalog-Nummer 12571) ergänzt mit 10% γ-bestrahlt gekennzeichnet Rinderfötenserum (CFB) (HyClone, Katalog-Nummer SH30071.03) und 10 mL / L von 45% Glucose-Lösung (Sigma, Katalog-Nummer G8769)) einen Tag vor der Transfektion. </li><li> Zum Zeitpunkt der Transfektion, bereiten Transfektionskomplexe wie folgt: <ol class="lalpha"><li> Verdünnen 8 pg DNA in 800 ul des Wachstums Medium ohne Serum in ein steriles Reaktionsgefäß. Vorsichtig mischen. </li><li> Verdünnen Sie 40 ul Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) in 800 ul des Wachstums Medium ohne Serum in einem Polystyrol-Röhrchen. </li><li> Fügen Sie die verdünnte DNA, um die verdünnte Lipofectamine ™. Vorsichtig mischen und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Wachstumsmedium von den Zellen in T75 und ersetzen mit 6,4 ml Wachstumsmedium ohne Serum. Fügen Sie die 1,6 ml Transfektionskomplexe in den Kolben. Vorsichtig mischen durch Schwenken der Platte. </li><li> Inkubieren Zellen bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator für 6 Stunden. </li><li> Add 8 ml Nährmedium in den Kolben und bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator über Nacht. </li><li> Entfernen Medium durch Absaugen und fügen frisches Wachstumsmedium in den Kolben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator über Nacht. </li><li> Ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit Selektionsmedium (MEMA-Medium ohne Nukleotide oder Nukleoside (Gibco, Katalog-Nummer 12561) ergänzt mit 10% γ-bestrahlten dialysiert fötales Rinderserum (DFBs) (HyClone, Katalog-Nummer SH30079.03) und 10 mL / L 45 % Glucose-Lösung (Sigma, Katalog-Nummer G8769)). </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator für 2-3 Wochen. </li></ol> 2. Das Klonen mittels Durchflusszytometrie Activated Cell Sorting <ol><li> Verdrängen Zellen aus dem Kolben und Zentrifuge bei 800 rpm für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in Selektionsmedium mit 2% Rinderserumalbumin und fluoreszenzmarkierten anti-human IgG-Antikörper bei 1:20 Verdünnung ergänzt. </li><li> Inkubieren auf Eis für 15-30 Minuten und dann zweimal mit kaltem PBS. Die Zellen in 1x PBS in einem Polypropylen-Rohr. </li><li> Bereiten Sie für die aseptische Art auf einer BD FACSAria ™. Bereiten 96-well Zellkulturplatte, die 200 ul Selektionsmedium in jede Vertiefung enthält. </li><li> Aseptisch Belastung der Röhre mit Zellen und zu analysieren, auf BD FACSAria ™, notieren Sie die Ergebnisse für gefärbten und ungefärbten Zellen. </li><li> Setzen Sie den Toren und Einstellungen auf einzelne Zellen des gewünschten Fluoreszenzfärbung Profil in 96-Well-Platte (n) zu sortieren. <ol class="lalpha"><li> Die transfizierten Zellen werden zunächst auf der Grundlage Vorwärtsstreuung gegenüber side scatter analysiert. Ein Tor für die lebenden Zellen basiert auf forward scatter, die eine Zelle der Größe und side scatter, die eine Zelle die Komplexität oder Granularität Maßnahmen Maßnahmen gemacht. </li><li> Die Zellen, die innerhalb dieses Tor fallen, sind dann für PE-Färbung untersucht. PE negative Gate ist für ungefärbte transfizierten Zellen oder gebeizt Wirtszellen gesetzt. Als gebeizt transfizierten Zellen durch FACS untersucht werden, ist die "High PE" gate dann abgegrenzt zu den Top 5% aller Zellen, die positiv für PE-Färbung umfassen. </li></ol></li><li> Die Inkubation bei 37 ° C Inkubator für zwei Wochen. </li></ol> 3. Dokumentation der Koloniebildung durch CloneSelect ™ Imager Document Koloniebildung in 96-Well-Platten auf CloneSelect Imager ™ am Tag 0, Tag 3, Tag 7 und Tag 13 nach FACS-Sortierung. Die Bilddokumentation wird dafür sorgen, Selektion von Klonen aus einer einzigen Zelle ab. Ein entscheidender Schritt in dieser Dokumentation ist immer der Brennebene richtig für den Tag 0 Messung eingestellt, da es nur eine Zelle in jedem gut an diesem Punkt. Es ist sehr wichtig, dass die Bilder von den einzelnen Zellen im Mittelpunkt stehen und versuchen, den Fokus auf sie einstellen können im besten Fall irreführend sein. Die Brennebene kann erheblich variieren zwischen den Marken von Platten und möglicherweise sogar von Charge zu Charge der gleichen Marke. So einer vorgegebenen Brennebene verwendet werden muss. Dies kann durch die Konzentration auf Test-Mikroperlen oder High-Density-Zellen auf Platten aus der gleichen Charge verwendet hinterlegt erreicht werden. Alternativ können ausgewachsen Platten aus der gleichen Charge für diesen Zweck verwendet werden. Nach FACS-Sorting, ist es auch wichtig, damit die Zellen für mindestens 2 Stunden vor Bildgebung zu regeln, so dass sie in der 'fixed' in der Position auf der Platte. 4. Screening und Auswahl von hoch produktiven Klone <ol><li> Document Probenposition in der empfangenden 96-Well-Assay-Platten. </li><li> Transfer-Aliquots von 20 ul Überstand (verdünnen) in 96-Well-Assay-Platten durch die Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System. Diese flexible und in der Lage Roboteric-Plattform hat für diese und andere automatisierte Zellkultur Arbeit angepasst. Spezielle Programme wurden geschrieben, um bestmöglich zu nutzen und zur Verbesserung der Freedom EVO Roboter-Fähigkeiten für die Entwicklung von Zelllinien. Ein Beispiel dafür ist die Einstellung der Tecan CloneSelect ™ Imager Daten zur Probenahme Brunnen mit einzelnen Kolonien zu interpretieren. Andere Programme erforderlich waren, um zusätzliche Zellkultur Aufgaben wie durchführen, um die geeigneten Verdünnungen der Proben, zu interpretieren, Katalog und Probe manuell markiert Platten zu machen, wenn erforderlich, zu skalieren hohe produzierende Klone, etc. Viele dieser Programme leicht angewendet, um 384-Well-Platten sowie die ursprüngliche 96-Well-Format. </li><li> Antikörper-Produktion in den Proben wird durch ein Sandwich menschliche IgG Nachweis ELISA (Pierce, Rockford, IL) auf dem Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System analysiert. <ol><li> Proben und Standard (Human Myelom IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) wurden auf vorbeschichtete Bio Coat Anti-Human IgG Assay-Platten (BD Biosciences, San Jose, CA) geladen. </li><li> Die Platten wurden bei Raumtemperatur für zwei Stunden durch drei PBS gewaschen, gefolgt inkubiert. </li><li> ImmunoPure Goat Anti-Human IgG (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) wurde die Platte in einer 1:2000-Verdünnung zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen, bevor Sie ABTS Substrat (Pierce, Rockford, IL) und wurden auf einem Teller Leser mit Absorption bei 405 nm zur Detektion lesen. </li></ol></li><li> Wählen Sie hochproduktive Klone und bewerten die Produktivität in Suspensionskultur. Für Fed-Batch-Kultur wurden die Zellen bei 0.3X106 Zellen / ml in Protein-freiem Medium JRH unmittelbaren Vorteil geimpft 65578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) mit 5 g / L Soja-Hydrolysat (DMV International, Katalog-Nummer SE50MAF-UF, viel ergänzt Zahl) und bei 37 ° C mit 7,5% CO 2. Die Kultur weiter und wurden mit 2 g / L Glucose (Sigma, Katalog-Nummer G8769, Losnummer 098K2329), wenn Glucose plus Laktat-Konzentration in der Kultur unter 2 g / L erreicht, und fütterte 2 mM Glutamin (Gibco, Katalog-Nummer 25030 ergänzt, Losnummer 568177), wenn Glutamin unter 200 erreichbar mg / L (Metaboliten von YSI Bioanalyzer gemessen). Fed-Batch-Kulturen wurden am Tag 14 und Antikörper-Produktion beendet wurde durch Umkehrphasen-HPLC gemessen. </li><li> Genetische Charakterisierung von Kandidaten Klone durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) 5. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel der Entwicklung von Antikörper produzierende Klone mit den hohen Durchsatz Methode ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Transfizierten Zelle Pool wurde mit fluoreszenzmarkierten anti-human IgG-Antikörper (Abbildung 1A) gebeizt, analysiert und sortiert auf BD FACSAria ™ (Abbildung 1B). Colony Formation in 96-Well-Platte wurde auf CloneSelect Imager ™ (Abbildung 1C) abgebildet. Zellkulturüberstand wurde aus Brunnen, die einzige Kolonie enthalten beprobt und untersucht mittels ELISA auf die Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System (Abbildung 1D). Hochproduktive Klone wurden aus Zellen, die höhere Oberflächentemperatur Antikörperspiegel durch Färbung mit fluoreszenzmarkierten anti-human IgG wider ausgestellt gefunden. Beim Vergleich der Klone aus zwei Populationen der ursprünglichen transfizierten Zell-Pools, einen großen Unterschied in der Produktivität in Fed-Batch-Kultur beobachtet (Abbildung 2) erzeugt wurde. Für die ersten beiden Klone aus der Zellpopulation mit hoher Oberfläche Antikörper Ausdruck (PE hoch) erzeugt wird, reicht die spezifische Produktivität von 50 bis 70 pg / Zelle / Tag. Während die Antikörper-Produktivität betrug ~ 20 pg / Zelle / Tag für die ersten beiden Klone aus der Zellpopulation mit geringer Oberfläche Antikörper Ausdruck (PE niedrig) generiert. Darüber hinaus sind Zelllinien durch FACS-Sortierung entwickelt stabiler in Bezug auf Antikörper-Produktion als solche, die durch manuelle Kalkung Verdünnung (Abbildung 3A) geklont wurden. Die spezifische Produktivität der Top-Klon, "Clone 1", durch manuelle Kalkung Verdünnung erzeugten fiel von ~ 30 pcd um ~ 10 nach Kultivierung für 80 Zellverdopplungen pcd. Auf der anderen Seite, oben Subklon durch FACS-Sortierung, "Clone 2" erzeugt werden, konnte die spezifische Produktivität um rund 20 pcd für mindestens 100 Zellverdopplungen aufrecht zu erhalten. Durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) haben wir gezeigt, Klon 1 zeigte eine gemischte Population von Phänotyp A (85%) und Phänotyp B (15%). Im Gegensatz dazu FACS Klon sortiert (Klon 2) zeigte, um eine homogene Bevölkerung, mit 99,5% der Zellen erwies sich als Phänotyp A (Abbildung 3B). <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Entwicklung von Fertigungs-Zelllinien für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern aus CHO-Zellen. A) Oberfläche Färbung der ersten transfizierten Zelle Pool mit fluoreszenzmarkierten anti-human IgG-Antikörper. B) Die Sortierung der Zellpopulation mit hoher Fluoreszenzintensität (PE hoch) und niedrige Fluoreszenzintensität (PE low) in 96-Well-Platte. C) Dokumentation KolonieBildung von Tag 0 bis Tag 13 post Aussaat auf CloneSelect Imager ™. D) Screening-Klone mittels ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Oberfläche verbunden Antikörpertiter korreliert mit Antikörper-Produktivität der Zelle. Klone mit hoher und niedriger Fluoreszenzfärbung waren beide in Zelllinien entwickelt und evaluiert in Fed-Batch-Kultur. Volumetrische Titer und die spezifische Produktivität wurden zwischen top 2 Klone jeder Population verglichen. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Klone aus FACS-Sorting weisen sie eine höhere genetische Homogenität und Stabilität Klon erzeugt. A) Antikörper-Produktion Stabilität in Batch-Kultur für ~ 80 Zellverdopplungen Kultur verstrichene Zeit. Δ, wurde der Klon durch limitierende Verdünnung, bei der Zellen bei 2000 Zellen ausgesät wurden / well, 1000 Zellen / Well und 500 Zellen / well erzeugt. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Schwarzes Dreieck" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Schwarzes Dreieck"> , Wurde der Klon durch FACS bei 1 Zelle / well erzeugt. B) Transgene Integration vor Ort in CHO-Zellen-Chromosom wird durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung identifiziert.

<ol><li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells%3A+improvement+through+gene+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li>
<li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li>
<li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting%3A+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li>
<li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li>
<li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation%3A+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytomery%22%5BJournal%5D)">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li>
<li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grenn+fluorescent+protein+%28GFP%29+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li>
<li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li>
<li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li>
</ol>

Die Autoren dieses Artikels sind die Mitarbeiter von Merck &amp; Co., Inc., die Verwendung dieser Methode für die großtechnische Herstellung von Protein-Therapeutika von Säugetier-Zelllinien.

Wir präsentierten eine automatisierte Fertigung zur Entwicklung von Zelllinien-Plattform, die Isolierung von hoch produktiven Klonen ermöglicht, und in der Zwischenzeit, während sichergestellt, Klonalität und Klon Stabilität. Das Engagement der Oberfläche Antikörper-Färbung von FACSAria ™ cell sorting gefolgt ist der Schlüssel zum Erhalt einzelner Klone mit hohen Antikörper-Produktivität. Unsere Ergebnisse und weitere Berichte 2-4 zeigen, dass die Antikörper-Ebene vorübergehend auf der Zelloberfläche angezeigt und mit der Produktivität der Zelle korreliert. So kann ein Fluorescein-konjugierten Antikörper verwendet, um die Membran zugehörigen Produkt zu erkennen und Hilfe zur Isolierung von hoher Produzenten werden. Alternativ haben Koexpression von Reporter-Genen und Gel microdrop Technologie eingesetzt, um die Auswahl an High-produzierende Klone durch FACS 6-8 erleichtern. Zusätzlich zu isolieren hohe produzierende Klone via FACS, haben andere Technologien entwickelt, um das gleiche Ziel zu erreichen. Dazu gehören Trellis Bioscience CellSpot Technologie, microspere Antikörper-Detection-Systeme und Laser-Screening-Technologie nutzt, um hochproduktive Klone zu identifizieren und zu eliminieren unerwünschte Zellen, Genetix ClonePix FL und StemCell Technologies ClonaCell EasyPick Plattform, die das Hochdurchsatz-Screening der Produktion Zelllinien mit Hilfe eines Fluoreszenz-Antikörper-Nachweis-System durchführen . Wir entschieden uns für die FACS Klonen Methode an der Oberfläche verbunden Antikörperspiegel Basis implementieren, da es die Einfachheit der Bedienung, Selektivität auf die Produktivität und Klonalität verbindet. Die Beschäftigung von Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System deutlich erhöht Screening-Durchsatz, der die Möglichkeit, sich für High-Yield-Klone aus einer viel größeren Zellpool wählen können. Andere Instrumente zur Analyse, wie HTRF, Bioforte Oktett, HPLC, etc, sind alle möglichen Mittel zur Auswahl Hochproduzenten und Screening niedrigen Produzenten. Durch die Verfolgung Klon Formation mit CloneSelect Imager ™ erwirtschafteten wir erforderlichen Unterlagen Klonalität mit digitalisierten Zelllinie Geschichte zu beweisen. Klonalität wird durch genetisch charakterisieren einzigen Transgen-Integration vor Ort auf dem Chromosom bestätigt. Eine Subklonierung Schritt, der in der Regel getroffen werden, um Klonalität zu gewährleisten, kann somit entfallen. Dies wird 4-8 Wochen Zeit für die Entwicklung von Zelllinien zu speichern. Zusammenfassend zeigten die Qualität Zelllinien durch die High-Throughput-automatisierte Plattform generiert eine hohe Produktivität, Produktion Stabilität und dokumentiert Zelllinie Geschichte, dass die Nachfrage für eine groß angelegte Produktion und aktuellen regulatorischen Anforderungen erfüllen sollte.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ Cell Sorter </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System </td><td> Tecan Group </td></tr></tbody></table>

ein automatisiertes hochdurchsatz-plattform für die entwicklung von manufacturing zelllinien für protein therapeutics

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Die schnell wachsenden biopharmazeutischen Industrie fordert rasche Entwicklung von hocheffizienten und zuverlässigen Produktionssysteme auf die zunehmende Forderung nach Medikamenten versorgt gerecht zu werden. Die Erzeugung von Produktions-Zelllinien ist traditionell manuellen Operationen, die arbeits-, Low-Durchsatz und anfällig für menschliche Fehler beteiligt sind. Wir berichten hier ein integriertes High-Throughput-und automatisierte Plattform für die Entwicklung der Herstellung von Zelllinien für die Herstellung von Protein-Therapeutika. Die Kombination von BD FACS Aria ™ Cell Sorter, CloneSelect ™ Imager und Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System hat einen hohen Durchsatz und eine effizientere Entwicklung von Zelllinien Prozess aktiviert. In diesem Betrieb werden die Produktion Wirtszellen zuerst mit einem Expressionsvektor trägt das Gen von Interesse 1, durch die Behandlung mit einer Auswahl Agenten gefolgt transfiziert. Die stabil transfizierten Zellen werden dann mit Fluoreszenz-markierten Anti-Human-IgG-Antikörper gefärbt und sind anschließend im Rahmen Durchflusszytometrie 2-4. Hochproduktive Zellen werden auf der Grundlage Fluoreszenzintensität ausgewählt und werden von single-cell sorting auf einer BD FACSAria ™ isoliert. Colony Bildung von Einzel-Zell-Stadium wurde mikroskopisch erkannt und eine Reihe von Zeit-Runden digitalen Bilder werden von CloneSelect ™ Imager für die Dokumentation der Zelllinie Geschichte genommen. Nach einzelnen Klone gebildet haben, wurden diese Klone für die Produktivität durch ELISA auf einem Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling durchgeführt System gezeigt. Etwa 2.000 - 10.000 Klone können pro Arbeitstakt mit dem aktuellen System-Setup zu sehen sein. Dieser integrierte Ansatz wurde genutzt, um hohe Produktion von chinesischen Hamsters (CHO)-Zelllinien für die Herstellung von therapeutischen monoklonalen Antikörper (mAb) sowie deren Fusionsproteine ​​zu erzeugen. Mit Hilfe der verschiedenen Arten der Erfassung Sonden kann die Methode für die Entwicklung anderer Protein-Therapeutika eingesetzt werden oder in andere Produktions-Host-Systeme angewendet werden. Im Vergleich zu den herkömmlichen manuellen Verfahren zeigte diese automatisierte Plattform Vorteile von erheblich erhöhter Kapazität, gewährleistet Klonalität Rückverfolgbarkeit in Zelllinie Geschichte mit elektronischer Dokumentation und einer stark reduzierten Möglichkeit in Bedienfehler.

Ein High-Throughput-, automatisierten Plattform zur Herstellung von Zelllinien-Entwicklung für die Herstellung von Protein-Therapeutika wird beschrieben. Implementierung von BD FACS Aria Cell Sorter hat CloneSelect Imager und Tecan Freedom EVO Liquid-Handling-System deutlich erhöht Verarbeitungskapazität in Zelllinien-Entwicklung mit verbesserten Zell-Linie Qualität und hohe Reproduzierbarkeit nachgewiesen.

Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

Die schnell wachsende biopharmazeutische Industrie verlangt nach einer beschleunigten Entwicklung hocheffizienter und zuverlässiger Produktionssysteme, um der steigenden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Herstellungszelllinien für Biopharmazeutika mit Klonalität und hoher Produktivität zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst die Wirtszelle mit DNA transfiert wird, die das Gen der Interesse codiert. Der nächste Schritt des Verfahrens ist die Isolierung hochproduktiver Klone mittels FACS, gefolgt von der Dokumentation der Koloniebildung durch den Clone Select Imager.Der letzte Schritt besteht darin, hochproduktive Klone zu screenen und auszuwählen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Antikörperproduktion in kontinuierlichen und fed-batch-Kulturen mittels HPLC in der Umkehrphase zeigen. Video: Die Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zum Sortieren und pcan 80 dgl aufgrund des komplexen Aufbaus dieser Verfahren schwer zu erlernen sind. Die folgenden Wissenschaftler aus einem Labor werden diese Verfahren demonstrieren: Transfektion der Wirtszelle durch Effekt, Sortierung durch Jason Sanders zur Dokumentation der Koloniebildung und TECAN-Probenahme durch Russell Kan.Und Eliza Beginnen Sie dieses Verfahren einen Tag vor der Transfektion, indem Sie die Wirtszellen in einem Zellkulturgefäß mit 15 Milliliter Wachstumsmedium ansäen. Inkubieren Sie die Zellen am folgenden Tag in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 7,5 % Kohlendioxid. Bereiten Sie am nächsten Tag zunächst die Transfektionskomplexe vor, indem Sie acht Mikrogramm DNA in 800 Mikroliter Wachstumsmedium ohne Serum in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig verdünnen und mischen. Verdünnen Sie anschließend 40 Mikroliter Lip in 800 Mikroliter Wachstumsmedium ohne Serum in einem Polystyrolröhrchen.Fügen Sie die verdünnte DNA zu dem verdünnten Lipofectamin hinzu. Vorsichtig mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Wirtszellen für die Transfektion vorzubereiten. Entfernen Sie das Wachstumsmedium von den Zellen und ersetzen Sie es durch 6,4 Milliliter Wachstumsmedium ohne Serum.Geben Sie 1,6 Milliliter der Transfektionskomplexe zu dem Kolben hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Schwenken des Kolbens. Inkubieren Sie die Zellen 6 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator.Nach sechs Stunden acht Milliliter Wachstumsmedium zum Kolben hinzufügen und am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubieren. Das Medium durch Absaugen entfernen und frisches Wachstumsmedium zum Kolben hinzufügen. Die Zellen nach der Übernacht-Inkubation erneut über Nacht inkubieren.Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch Selektionsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für zwei bis drei Wochen. Zwei bis drei Wochen nach der Transfektion sind die Zellen bereit zum Klonen mittels durchflusszytometrischer aktivierter Zellsortierung; lösen Sie die Zellen aus dem Kolben und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 800 U/min und vier Grad Celsius.Suspendieren Sie die Zellen in Selektionsmedium, ergänzt mit 2 % Rinderserumalbumin. Fügen Sie dann fluoreszenzmarkierten anti-humanen IgG-Antikörper hinzu. Verdünnen Sie im Verhältnis 1:20, inkubieren Sie 15 bis 30 Minuten auf Eis und waschen Sie anschließend zweimal mit kalter PBS; suspendieren Sie die Zellen in einem XPBS in einem Polypropylenröhrchen.Ein Beispiel gefärbter Zellen ist auf diesem Bild für die sterile Sortierung auf einem BD FACS Aria dargestellt. Bereiten Sie eine 96-Well-Zellkulturplatte vor, die in jedem Well 200 µL Selektionsmedium enthält. Laden Sie die Zellen aseptisch in die Röhre und analysieren Sie sie am BD FACS Aria. Notieren Sie die Ergebnisse für gefärbte und ungefärbte Zellen jeweils getrennt.Stellen Sie die Gates und Einstellungen so ein, dass Einzelzellen mit dem gewünschten fluoreszierenden Färbeprofil in die 96-Well-Platte sortiert werden. Inkubieren Sie die Platte zwei Wochen lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Am Tag null, Tag drei, Tag sieben und Tag 13 nach der Zellsortierung dokumentieren Sie die Koloniebildung in der 96-Well-Platte mithilfe eines Clone Select Imagers, um sicherzustellen, dass Klone, die von einer Einzelzelle abstammen, ausgewählt werden, und um hochproduktive Klone zu screenen und auszuwählen. Dokumentieren Sie zunächst die Probenposition in der empfangenden 96-Well-Assayplatte. Anschließend verwenden Sie ein robotergestütztes Flüssigkeitshandling-System, um Aliquote von 20 µL Überstand in jedes Well der 96-Well-Assayplatte zu übertragen. Die Antikörperproduktion in den Proben wird mittels eines Sandwich-ELISA analysiert.ELISA zur Detektion von humanem IgG am Flüssigkeitshandhabungssystem wie folgt: Zunächst werden die Proben und ein Standard auf vorkodierte Bio-Coat-Anti-human-IgG-Assayplatten aufgetragen. Die Platten werden zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von drei Waschschritten mit PBS.Anschließend wird immunschieres Ziegen-Anti-Human-IgG-HRP in einer Verdünnung von 1 zu 2000 zu den Platten gegeben, und die Platten werden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Stunde werden die Platten dreimal mit PBS gewaschen und anschließend das A BTS-Substrat hinzugefügt.Schließlich werden die Platten auf einem Plattenreader mit einer Absorption bei 405 Nanometern zur Detektion rot eingefärbt. Mithilfe dieser automatisierten Plattform zeigte sich, dass der Oberflächenantikörperspiegel, der durch Färbung mit fluoreszenzmarkiertem anti-humanem IgG sichtbar gemacht wird, mit der Antikörperproduktivität der Zelle korreliert. Wie hier für die beiden besten Klone dargestellt, die aus der Zellpopulation mit hohem Oberflächenantikörperausdruck hervorgegangen sind, lag die spezifische Produktivität zwischen 50 und 70 Pikogramm pro Zelle pro Tag.Im Gegensatz dazu betrug die Antikörperproduktivität für die beiden besten Klone, die aus der Zellpopulation mit geringer Oberflächenexpression von Antikörpern hervorgingen, etwa 20 Pikogramm pro Zelle und Tag. Außerdem sind Zelllinien, die durch FACS-Sortierung entwickelt wurden, bezüglich der Antikörperproduktion stabiler als solche, die durch manuelle limitierende Verdünnung geklont wurden. Die spezifische Produktivität des besten Klon, Klon eins, der durch manuelle limitierende Verdünnung erzeugt wurde, sank nach 80 Zellverdopplungen in Kultur von etwa 30 PCD auf etwa 10 PCD.Andererseits konnte der Top-Subklon, der durch FACS-Sortierung der Klon zwei generiert wurde, die spezifische Produktivität über etwa 20 PCD für mindestens 100 Zellverdopplungen aufrechterhalten. Die Identifizierung der Transgenintegrationsstelle im Zellchromosom mittels fluoreszierender in-situ-Hybridisierung zeigte, dass Klon eins eine gemischte Population aus Phänotyp A und Phänotyp B darstellt. Im Gegensatz dazu erschien der FACS-sortierte Klon als homogenere Population mit 99,5 % der Zellen des Phänotyps A. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Herstellungszelllinien zur Produktion therapeutischer Proteine entwickelt.

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Medizin

Wir stellen eine mikrofluidische Ansatz für die Expression von Protein-Arrays. Die Vorrichtung besteht aus Tausenden von Reaktionskammern durch mikromechanische Ventile gesteuert. Mikrofluidische Vorrichtung mit einer Mikroarray-bedruckte Genbibliothek gepaart. Diese Gene werden dann transkribiert und translatiert auf dem Chip, was zu einem Protein-Array bereit zu Versuchszwecken verwendet.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen es Laboren, skalierbare, adhärente Stammzellkulturen mit minimalem Arbeitsaufwand, Erfahrung und Ausrüstungsinvestitionen mit einem programmierbaren Liquid-Handling-Roboter und 96-Well-Platten durchzuführen.  iPSCs, die mehr als 20 Mal auf diesem System durchlaufen wurden, behielten die Pluripotenz bei, normalisierte Karyotypen und differenzierten sich zu Kardiomyozyten.

Scalable Platte mit 96 Vertiefungen Basierend iPSC Kultur und Produktion Mit einem Robotic Flüssigkeitshandhabungssystem

Ein detailliertes Protokoll für den gleichzeitigen Betrieb von 48 parallel Zellkulturen unter unterschiedlichen Bedingungen in einem Microbioreactor-System wird vorgestellt. Zellprozess Kultur, Ernte und anschließende Antikörper-Titer Analyse werden beschrieben.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automatisierung ist der Schlüssel zum Upscaling und Kostenmanagement in der Zellfertigung. Dieses Manuskript beschreibt den Einsatz eines Gegenstromzentrifugalzellverarbeitungsgeräts zur Automatisierung des Pufferaustauschs und der Zellkonzentrationsschritte für die kleinräumige Bioverarbeitung.

Automatisiertes Gegenstromzentrifugalsystem für die Kleinzellverarbeitung

Wir zeigen die Automatisierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellkulturen (hiPSC) und neuronalen Differenzierungen, die mit automatisierter Bildgebung und Analyse kompatibel sind.

Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Herstellung von adhärenten Zellen in großem Maßstab durch ein vollständig geschlossenes System auf der Basis von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität zu erreichen. Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen, HEK293T Zellen und Vero-Zellen wurde validiert und erfüllte sowohl die Quantitätsanforderungen als auch die Qualitätskriterien für die Zell- und Gentherapieindustrie.

Großtechnische Zellproduktion auf Basis von auflösbaren porösen Mikroträgern in GMP-Qualität

Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess für chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für den klinischen Einsatz, insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Zellprozessors, der in der Lage ist, virale Transduktion und Kultivierung von T-Zellen durchzuführen. Wir geben Empfehlungen und beschreiben Fallstricke, die bei der Prozessentwicklung und Durchführung einer frühen klinischen Studie berücksichtigt werden sollten.

Herstellung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf einem automatisierten Zellprozessor

Dieses Protokoll dokumentiert die Herstellung und Montage von SPOT, einer auf Gerüsten basierenden Hochdurchsatz-Kulturplattform, in den Formaten 96 und 384 Wells. Außerdem wird der Aussaatprozess für SPOT sowohl manuell als auch mit einem handelsüblichen Liquid-Handler beschrieben.

Reproduzierbare Herstellung von SPOT als Gerüst-basierte Kulturplattform mit hohem Durchsatz

Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare Methode zur Erweiterung von Adoptive Cell Therapies (ACT)-Produkten, nämlich Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-Zellen und Cytokine-Induced Killer (CIK)-Zellen, mit gasdurchlässigen Rapid Expansion (G-Rex)-Geräten, die ein effizientes und robustes Wachstum in einem klinisch relevanten Kontext nachweisen.

Effiziente und schnelle Erzeugung von CAR-T- und zytokininduzierten Killerzellen in GMP-skalierbaren Geräten

Erfahren Sie die automatisierte Hochdurchsatz-Plattform zur Zelllinienentwicklung für therapeutische Proteine. Diese Methode nutzt Durchflusszytometrie und Bildgebung zur Isolierung hochproduktiver Klone.

Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

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