Kultivierung von Speichelsphären aus Speicheldrüsengewebe: Eine Methode zur Entwicklung von Salisphären aus menschlichen Speicheldrüsen-Epithelzellen

Salisphären sind in vitro selbstaggregierende Kulturen von Epithelzellen, die aus der Speicheldrüse stammen. Um Speichelsphären zu kultivieren, beginnen Sie damit, das menschliche Speicheldrüsengewebe in einer Kulturplatte zu entnehmen.

Mit einer Schere das Taschentuch in feine Stücke hacken. Ergänzen Sie diese Stücke anschließend mit einer Dissoziationslösung, die Kollagenase- und Dispase-Enzyme enthält, und inkubieren Sie. Diese Enzyme verdauen die im Gewebe vorhandene extrazelluläre Matrix.

Reiben Sie weiter, um das Gewebe zu homogenisieren. In diesem Schritt werden die Epithelzellen und Erythrozyten in die Lösung freigesetzt. Verwenden Sie anschließend ein Zellsieb und filtrieren Sie das Gewebehomogenat in ein frisches konisches Röhrchen, um unverdaute Gewebestücke und Ablagerungen zu entfernen. Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Zellpellet im Erythrozyten-Lysepuffer resuspendiert. Dieser Puffer reißt die in der Zellsuspension vorhandenen Erythrozyten auf.

Zentrifugen Sie nun, um die Epithelzellen zu pelletieren. Resuspendieren Sie das Pellet in ein geeignetes epitheliales Zellwachstumsmedium. Bereiten Sie zusätzlich die Salisphären-Kulturplatte vor, indem Sie die Vertiefung mit einer verflüssigten Basalmembranmatrix oder BMM beschichten. Inkubieren, damit sich die Matrix verfestigen kann.

Geben Sie abschließend die Epithelzellsuspension in die BMM-beschichteten Wells. In Gegenwart von Wachstumsmedien heften sich Epithelzellen an die BMM-Schicht und vermehren sich zu kugelförmigen Speichelkugeln.

Innerhalb von zwei bis vier Stunden nach der Entnahme aus dem Patienten wird das Speicheldrüsengewebe auf einer Kulturplatte mit einer autoklaviersterilisierten Präparierschere und einer chirurgischen Zange in feine Stücke von der Größe von 1 bis 2 Millimetern zerkleinert. Geben Sie 6 Milliliter der Dispase-/Kollagenaselösung in das zerkleinerte Gewebe. Dann bei 37 Grad Celsius für etwa 30 Minuten bis eine Stunde inkubieren.

Unterbrechen Sie das Gewebe, indem Sie mit der serologischen 5-Milliliter-Pipette 15 bis 20 Mal pipettieren. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für weitere 30 Minuten bis eine Stunde. Wiederholen Sie den Pipettier- und Inkubationsschritt zwei bis drei weitere Male oder bis das Gewebe einer Aufschlämmung ähnelt und leicht durch die Pipettenöffnung gelangen kann.

Um Wells mit BMM zu beschichten, pipettieren Sie langsam 500 Mikroliter über Nacht aufgetautes BMM in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Schwenken Sie die Platte langsam, um das BMM gleichmäßig über die Vertiefungen zu verteilen. Inkubieren Sie die beschichteten Platten dann vor der Verwendung mindestens 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit sich das BMM verfestigen kann.

Die Dispase/Kollagenase-Lösung, die das homogenisierte Gewebe enthält, wird in ein konisches 15-Millimeter-Röhrchen überführt. Waschen Sie die Wand der Platte einmal mit 6 Millilitern DPBS, um die restlichen Zellen in das konische Röhrchen zu übertragen. Filtrieren Sie dann das Homogenat durch ein 70-Mikrometer-Nylonnetz-Zellsieb in ein neues konisches 50-Millimeter-Röhrchen, um unverdautes Gewebe zu entfernen.

gespannten Zellen werden 5 Minuten lang bei 500 x g zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt. Anschließend resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern 1x RBC-Lysepuffer. 5 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie dann 20 bis 25 Millimeter DPBS hinzu, um den Erythrozyten-Lysepuffer zu neutralisieren und die Lyse von Speichelzellen zu minimieren.

5 Minuten lang bei 500 x g zentrifugieren. Weißkörperchen-Pellet zeigt die vollständige Lyse aller Erythrozyten an. Wenn das Pellet eine rote Farbe hat, wiederholen Sie die Behandlung mit RBC-Lysepuffer. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 bis 2 Millilitern BEGM und übertragen Sie dann die resuspendierten Zellen in BMM-beschichtete Vertiefungen.

Inkubieren bei 37 Grad Celsius. Nach der Beschichtung auf BMM bilden sich die Zellen über einen Zeitraum von zwei bis drei Tagen zu kugelförmigen Strukturen oder Salisphären. Die Zellen können etwa fünf bis sieben Tage lang als Speichelkugeln aufbewahrt werden, bevor das BMM abgebaut wird, so dass die Zellen auf den Kunststoff zugreifen und daran haften und als Monoschicht wachsen können.