Blasentumor-Organoidmodell: Eine Methode zur orthotopen Transplantation von Blasenorganoiden in die Empfänger-Mausblase
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 4:15 Min. • April 30th, 2023
Patienten-Tumor-Organoide sind Miniaturtumoren, die sich aus dem Elternorgan entwickelt haben. Bei der Transplantation in ein Tiermodell behalten diese Organoide die meisten phänotypischen und genetischen Eigenschaften des ursprünglichen Tumors bei, was eine personalisierte Krebstherapie ermöglicht. Zum Beispiel färben sich Blasenkrebs-Organoide für viele zelluläre Marker positiv wie ihr entsprechender elterlicher Tumor.
Um ein Tumor-Organoid-Modell zu entwickeln, beginnen Sie mit einer Kultur von Blasentumor-Organoiden. Kollagenase-Enzymsuspension in die Organoidkultur geben und inkubieren. Kollagenase baut die Matrixbestandteile auf. Fügen Sie nun ein vorgewärmtes Nährmedium hinzu, um die freien Organoide in Suspension freizusetzen. Zentrifugieren Sie bei niedriger Temperatur, um die verbleibende Kollagenaseaktivität zu neutralisieren und das Organoid-Pellet zu erhalten.
Der Überstand, der neutralisierte Enzyme und abgebaute Matrixkomponenten enthält, wird verworfen und das Pellet in frischen Medien wieder suspendiert. Übertragen Sie die Organoid-Suspension in ein Wachstumsmedium, das die Basalmembranmatrix enthält. Ziehen Sie anschließend das Organoid und die Mediensuspension in eine Spritze und injizieren Sie es in die Vorderwand einer chirurgisch freigelegten, anästhesierten Nacktmausblase.
Das komplexe Netzwerk der Basalmembranmatrix hilft, die Organoide einzufangen und erleichtert ihre Integration in die Blasenwand. Die Blasenwand ahmt die Mikroumgebung des Elterntumors nach, so dass sich die Organoide zu einem Tumor entwickeln können, der die Morphologie und Pathogenese des ursprünglichen Krebses widerspiegelt.
Um die Blasentumor-Organoide für die orthotope Transplantation vorzubereiten, geben Sie 500 Mikroliter Kollagenase/Dispase in einer 24-Well-Platte in das Organoid-Medium. Pipettieren Sie die Basalmembranmatrix und das Medium auf und ab. Dann inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Nach der Inkubation die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen geben und 5 Milliliter vorgewärmtes DMEM hinzufügen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 3 Minuten bei 4 Grad Celsius und aspirieren den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 Milliliter DMEM und geben Sie die Lösung in eine 90-Millimeter-Petrischale.
Unter dem Mikroskop werden mit einer P200-Pipette 10 bis 100 Tumororganoide entnommen und in einem Mikroröhrchen auf Eis gesammelt. Zentrifugieren Sie das Mikroröhrchen und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Halten Sie das Pellet dann auf Eis, bis die Mäuse für die Operation bereit sind. Bewahren Sie vor der submukkösen Blasenwandtransplantation die Spritzen, Pipettenspitzen und die Basalmembranmatrix bis zur Verwendung auf Eis auf.
Nachdem die Maus betäubt wurde, legen Sie sie in Rückenlage und halten Sie die Narkose durch Maskeninhalation von 2% verdampftem Isofluran aufrecht. Tragen Sie Povidon-Jod mit einer sterilen Gaze auf und wischen Sie es mit 70% Ethanol ab. Machen Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere einen kleinen Querschnitt in die Haut und die Muskelwand des unteren Mittellinienbauchs. Legen Sie die Blase aus der Bauchhöhle frei und stützen Sie sie mit einem in Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen.
Resuspendieren Sie die Organoid-Pellets in 80 Mikrolitern Organoid-Medium, das 50 % hochkonzentrierte Basalmembranmatrix enthält, und injizieren Sie die Suspension mit der Insulinspritze in den vorderen Aspekt der Blasenkuppel. Verschließen Sie den Schnitt mit einer 4-0-Nylonnaht und desinfizieren Sie die Operationsstelle mit Povidon-Jod und 70% Ethanol. Lassen Sie die Maus 10 bis 15 Minuten lang unter einem Infrarotstrahler ruhen. Überwachen Sie dann die Maus erneut, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt.
Übersicht
In diesem Artikel wird die Entwicklung von patientenabgeleiteten Tumororganoiden beschrieben, die winzige Tumore sind und die Eigenschaften des ursprünglichen Tumors beibehalten. Diese Organoiden werden für die personalisierte Krebstherapie, insbesondere beim Blasenkrebs, verwendet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Translationale Medizin
Hintergrund
- Aus dem Ausgangstumor werden patientenabgeleitete Tumororganoiden erzeugt.
- Sie bewahren die phänotypischen und genetischen Eigenschaften des ursprünglichen Tumors.
- Diese Organoiden ermöglichen personalisierte Krebsbehandlungsstrategien.
- Blasenkrebs-Organoiden werden insbesondere aufgrund ihrer Ähnlichkeiten in Bezug auf zelluläre Marker hervorgehoben.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Modells zur Untersuchung von Blasenkrebs.
- Ermöglichung der Integration von Organoiden in tierische Modelle für die Forschung.
- Verbesserung personalisierter Therapieansätze mithilfe der Organoid-Technologie.
Verwendete Methoden
- Kultivierung von Harnblasentumor-Organoide mit Kollagenase-Behandlung.
- Injektion der Organoide-Suspension in die Harnblase anästhesierter Mäuse.
- Verwendung einer Basalmembran-Matrix zur Förderung der Organoide-Integration.
- Chirurgische Techniken für die orthotope Transplantation in die Harnblasenwand.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Beibehaltung der Tumoreigenschaften in Organoiden nach Transplantation.
- Integration der Organoiden in die Harnblasenwand, wodurch das Mikromilieu des ursprünglichen Tumors nachgeahmt wird.
- Nachgewiesenes Potenzial für die personalisierte Krebstherapie unter Verwendung von Organoidmodellen.
- Methode etabliert für zukünftige Forschungsvorhaben zum Harnblasenkarzinom.
Schlussfolgerungen
- Patientenabgeleitete Organoide eignen sich gut zur Untersuchung von Blasenkrebs.
- Sie bieten eine Plattform für personalisierte Behandlungsstrategien.
- Die Methodik kann für andere Krebsarten angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die orthotopische Transplantation von Harnblasentumor-Organoide ermöglicht eine physiologisch relevante Modellierung von Tumor-Stroma-Interaktionen in vivo. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Entschärfung von therapeutischen Maßnahmen beim Harnblasenkarzinom, indem die native Tumorarchitektur und mikroumgebungsbedingte Signale erhalten bleiben. Er stellt ein prädiktives präklinisches System zur Bewertung der Arzneimittelwirkung und des Tumorprogressionsverlaufs in einem klinisch übertragbaren Kontext bereit.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Blasenkrebs-Zielstrukturen innerhalb eines intakten Gewebemikromilieus.
- Operativer Wert: Erhält die Tumorheterogenität und stromalen Wechselwirkungen, die in Monolayer-Kulturen verloren gehen.
- Strategischer Wert: Erhöht die Zielgenauigkeit, indem molekulare Störungen direkt mit phänotypischen Ergebnissen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Dosis-Wirkungs-Bewertung von Verbindungen in einer 3D-Architektur, die der in-vivo-Wirksamkeit von Arzneistoffen nachempfunden ist.
- Operationaler Wert: Erzeugt quantifizierbare Endpunkte wie Tumoreinwachsen und Wachstumsdynamik.
- Strategischer Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitverbindungen, indem falsch-positive Ergebnisse aus künstlichen Kultursystemen reduziert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert orthotopisches Tumorwachstum und Invasionsmuster, die für die Pathogenese des menschlichen Blasenkarzinoms relevant sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Überwachung der Tumorentwicklung mittels bildgebender Verfahren oder biomarkerbasierter Messungen.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem die Modulation des Zielmoleküls an einem klinisch relevanten anatomischen Ort nachgewiesen wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode schließt die Lücke zwischen der frühen Entdeckung und der präklinischen Validierung, indem sie ein reproduzierbares orthotopes Modell für die Evaluierung von Blasenkrebs-Zielstrukturen bereitstellt.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Tumor-Stroma-Interaktionen und mikroumgebungsabhängigen Signalwegen.
- Screening: Ermöglicht die Wirkstoffprüfung in einem erhaltenen extrazellulären Matrixkontext, der die Arzneimittelverfügbarkeit und -wirksamkeit beeinflusst.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse, einschließlich der Effizienz der Organoid-Engraftment und des Tumorvolumens über die Zeit.
- Translationale Forschung: Passt sich biomarkerbasierten Studien an, indem die ursprünglichen molekularen Signatur des Tumors nach der Transplantation erhalten bleibt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Plattform für die iterative Validierung von Zielstrukturen über verschiedene Blasenkrebs-Subtypen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die native Tumorarchitektur und die stromale Zusammensetzung erhalten bleiben.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Protokolle zur enzymatischen Dissoziation und Matrixeinbettung.
- Strategischer Wert: Reduziert das Risiko bei der Zielstrukturauswahl, indem die phänotypische Reaktion in einem orthotopen Modell nachgewiesen wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Blasenkrebstherapeutika basierend auf in-vivo-ähnlichen Wirksamkeitsdaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Organoidkultur, Mikrochirurgie und Anästhesie-Management bei murinen Modellen.
- Setzt den Zugang zu einer Basalmembranmatrix (z. B. Matrigel) sowie zu Kollagenase/Dispase für die Organoidpräparation voraus.
- Erfordert aseptische chirurgische Technik und postoperative Überwachung für einen erfolgreichen Engraftment.
- Eingeschränkt durch die Vitalität der Organoiden während der Präparation und Injektion, was eine Kühlkettenlagerung bis zur Transplantation notwendig macht.
- Die Skalierbarkeit ist durch die chirurgische Kapazität bei Mäusen und die postoperative Erholungszeit begrenzt.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026