Extrazelluläre DNA-Färbung: Eine Methode zur Identifizierung extrazellulärer DNA in FFPE-Gewebeschnitten

Eine sterbende Zelle setzt außerhalb der Zelle einen Teil der DNA frei, der als extrazelluläre DNA bezeichnet wird. Um extrazelluläre DNA zu färben, beginnen Sie mit einem formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitt auf einem Objektträger. Erhitzen Sie den Objektträger für die gewünschte Dauer. Dies erleichtert die Befestigung von Gewebe auf der Objektträgeroberfläche und macht das umgebende Paraffin weich.

Tauchen Sie den Objektträger in Entparaffinierungsflüssigkeit, um die Paraffinschicht um das Gewebe herum vollständig aufzulösen. Tauchen Sie anschließend den Objektträger in abnehmende Ethanolkonzentrationen, um das entparaffinisierte Gewebe zu rehydrieren. Tauchen Sie den Objektträger nach der Rehydrierung in kochende Antigen-Rückgewinnungslösung. Bei dieser Behandlung werden die Epitope demaskiert, die während des Fixationsprozesses verändert wurden.

Überlagern Sie den Objektträger mit primären Antikörpern und lassen Sie sie an spezifische, unmaskierte Epitope binden, die auf der Zelle vorhanden sind. Fügen Sie dann fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper hinzu, die an die Primärantikörper binden. Tauchen Sie den Objektträger in Sudan Black-Lösung, um die Hintergrund-Autofluoreszenz zu reduzieren.

Zum Schluss geben Sie einen Tropfen mit DAPI ergänztes Eindeckmedium über den Gewebeschnitt und verschließen diesen mit einem Deckglas. Inkubieren, damit die DAPI-Moleküle die DNA färben können. Visualisieren Sie den präparierten Gewebeschnitt mit einem Fluoreszenzmikroskop. Fluoreszenzmarkierte Epitope in der Zelle helfen bei der Unterscheidung der in der Zelle vorhandenen Kern-DNA von der extrazellulären DNA.

Für die extrazelluläre DNA-Färbung erhitzen Sie zunächst die interessierenden Proben im Objektträgergestell 60 Minuten lang bei 60 Grad Celsius, bevor Sie die Objektträger in zwei 40-minütige Lösungsmittelwechsel in einem Abzug tauchen. Nach dem zweiten Eintauchen rehydrieren Sie die Proben zweimal in 100 % Ethanol und einmal in 70 % Ethanol für 5 Minuten pro Behandlung.

Nach der letzten Behandlung die Objektträger mit einer Zange 10 Minuten lang in kochende Antigen-Rückgewinnungslösung in einem Schnellkochtopf auf hoher Stufe legen. Nachdem Sie die Antigen-Epitope demaskiert haben, stellen Sie den Schnellkochtopf vom Herd in eine Spüle und lassen Sie sofort kaltes Leitungswasser über den Deckel laufen.

Lassen Sie die Objektträger 20 Minuten lang in der Antigen-Rückgewinnungslösung äquilibrieren, bevor Sie die Proben zweimal in 0,01 molaren PBS auf einem Orbitalschüttler für 5 Minuten pro Waschgang waschen. Zeichnen Sie nach dem zweiten Waschen mit einem hydrophoben Stift Kreise um die Nierengewebeproben und blockieren Sie unspezifische Färbungen mit 60 Mikrolitern 10 % Hühnerserum in 5 % Rinderserumalbumin für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Am Ende der Inkubation wird die Blockierungslösung vorsichtig durch 60 Mikroliter des interessierenden Primärantikörpers in einer Feuchtigkeitskammer über Nacht bei 4 Grad Celsius ersetzt. Waschen Sie die Objektträger am nächsten Morgen auf einem Orbitalschüttler in PBS für 2 Minuten pro Waschgang, bevor Sie jedem Objektträger 60 Mikroliter eines geeigneten Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpers für eine 40-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Objektträger wie gezeigt in PBS, gefolgt von einer Behandlung in 0,3 % Sudan Black in 70 % Ethanol, um eine mögliche Formalin-induzierte Autofluoreszenz zu löschen. Waschen Sie die Objektträger nach 30 Minuten in Leitungswasser, um Niederschläge zu entfernen, und tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in PBS, um eine weitere Bildung von Sudan Black-Niederschlägen zu verhindern.

Montieren Sie am Ende der Inkubation die Objektträger mit 360-Mikroliter-Tropfen Eindecklösung auf konfokale Glasdeckgläser, die mit DAPI ergänzt werden, und versiegeln Sie die Deckgläser mit Nagellack. Lassen Sie die Objektträger 24 Stunden bei Raumtemperatur aushärten. Lagern Sie sie bei 4 Grad Celsius lichtgeschützt bis zur Bildgebung durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie gemäß Standardprotokollen.