Warum ist die Nullhypothesenprüfung für die Validierung der Podocyten-Differenzierung wichtig?

Die Nullhypothesenprüfung ist entscheidend, um festzustellen, ob beobachtete Veränderungen in Podocytenmerkmalen auf den Differenzierungsprotokoll oder auf zufällige Schwankungen zurückzuführen sind, und unterstützt so eine robuste Zielvalidierung in der Nierenforschung.

Wie passt die Isolierung unabhängiger Variablen in iPSC-zu-Podozyten-Arbeitsabläufe ein?

Die Isolierung von Variablen wie der Zusammensetzung des Kulturmediums oder der Inkubationszeit ermöglicht es Teams, Differenzierungsresultate gezielt Modifikationen des Protokolls zuzuordnen, wodurch die Optimierung und Reproduzierbarkeit im Entdeckungsstadium verbessert wird.

Was ermöglichen quantitative Podocyten-Messungen in Nephrotoxizitätsassays?

Die quantitative Beurteilung der Podocyten-Morphologie und -Lebensfähigkeit ermöglicht einen objektiven Vergleich der Wirkstoffeffekte und unterstützt datengestützte Entscheidungen bei der nephrotoxischen Screening- und Assay-Entwicklung.

Warum sind Replikationsanforderungen für funktionell vielfältige Podocytenstudien entscheidend?

Die Replikation stellt sicher, dass die Differenzierung von Podocyten und die Ergebnisse der Assays zwischen verschiedenen Teams und Experimenten konsistent sind, was den zuverlässigen Austausch von Daten sowie kollaborative Forschungs- und Entwicklungsaktivitäten erleichtert.

Welche statistischen Analysefähigkeiten sind vor der Implementierung eines Podocyten-Assays erforderlich?

Zur Analyse der Differenzierungseffizienz, der Reproduzierbarkeit von Tests und der Behandlungseffekte sind robuste statistische Werkzeuge erforderlich, um sicherzustellen, dass podocytenbasierte Daten den unternehmensweiten Standards für Forschung und Entwicklung zur Entscheidungsfindung genügen.

Ableitung humaner Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen: Ein Verfahren zur gerichteten Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus Stammzellen

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

0 Ansichten • 4:19 Min. • April 30th, 2023

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Reife Zellen können so umprogrammiert werden, dass sie wieder in ihren stammzellähnlichen, undifferenzierten und proliferativen Zustand gelangen. Diese reprogrammierten Zellen werden als induzierte pluripotente Stammzellen oder IPSCs bezeichnet. Um pluripotente Zellen in Podozyten-spezialisierte Zellen zu differenzieren, die an der Filtration von Nierenabfällen beteiligt sind, beginnen Sie mit der Einnahme einer Suspension von humanen IPSCs in einem Mesoderm-Induktionsmedium.

Übertragen Sie diese Suspension auf eine mit Kellermatrix beschichtete Kulturplatte und inkubieren Sie. Die Kellermatrix erleichtert die Verklebung von IPSCs an der Basis. Anschließend induzieren die spezifischen Faktoren, die in den Medien vorhanden sind, die Differenzierung von IPSCs in die Mesodermzellen, die Vorläuferzellen für Podozyten. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium.

Ergänzen Sie die Platte mit dem gewünschten Volumen eines intermediären Mesoderm-Induktionsmediums und inkubieren Sie für eine längere Zeit. Dieser Schritt führt zur Differenzierung der mesodermalen Zellen in unreife Podozyten. Ersetzen Sie das intermediäre Mesoderm-Induktionsmedium durch eine Trypsinlösung, um die adhärenten Zellen von der Platte zu dissoziieren.

Als nächstes zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand, der die Trypsinlösung und die Matrixfragmente enthält, ist zu verwerfen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Podozyten-Induktionsmedium. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine frisch beschichtete Kulturplatte. Inkubieren, um die Entwicklung mehrerer fußartiger Vorsprünge aus Zwischenzellen zu ermöglichen, was zur Bildung reifer Podozyten führt.

Nach der Zählung resuspendieren die Zellen auf eine Konzentration von 1 mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter Mesoderm-Induktionsmedium und aspirieren Sie die extrazelluläre Matrixlösung aus den mit Basalmembranmatrix 2 beschichteten Platten. Spülen Sie die Platten zweimal mit warmem Medium ab und mischen Sie die humaninduzierte pluripotente Stammzellsuspension durch sanftes Pipettieren.

Geben Sie 1 Milliliter Zellen in jede Vertiefung der Basalmembranmatrix 2-beschichteten 12-Well-Platten und schütteln Sie die Platten vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen. Legen Sie dann die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie an den Tagen 2 bis 15 der Differenzierung das Mesoderm-Induktionsmedium durch 1 Milliliter intermediäres Mesoderm-Induktionsmedium pro Well.

Wenn ein erhebliches Zellwachstum und eine schnelle Erschöpfung der Nährstoffe beobachtet wird, was durch eine Vergilbung des Mediums angezeigt wird, kann das Volumen des intermediären Mesoderm-Differenzierungsmediums auf 1,3 Milliliter pro Vertiefung erhöht werden. Am Tag 16 der Kultur spülen Sie die intermediären Mesodermzellen mit warmem Medium und inkubieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,05 % Trypsin-EDTA pro Vertiefung für 3 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Wenn die Zellen zu dissoziieren beginnen, kratzen Sie die Zellen mit einem Zellheber ab und mischen Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren. Stoppen Sie die Reaktion mit etwa 2 Millilitern Trypsin-Neutralisationslösung pro Vertiefung und geben Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Bringen Sie das Volumen mit Medium auf 50 Milliliter und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das Pellet und das Podozyten-Induktionsmedium in einer Konzentration von 1 mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter des Mediums und geben Sie die Zellen zu Basalmembran-Matrix-2-beschichteten Platten. Schütteln Sie dann die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen, und legen Sie die Zellen für bis zu 5 Tage in den Inkubator.