Ableitung humaner Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen: Ein Verfahren zur gerichteten Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus Stammzellen

Reife Zellen können so umprogrammiert werden, dass sie wieder in ihren stammzellähnlichen, undifferenzierten und proliferativen Zustand gelangen. Diese reprogrammierten Zellen werden als induzierte pluripotente Stammzellen oder IPSCs bezeichnet. Um pluripotente Zellen in Podozyten-spezialisierte Zellen zu differenzieren, die an der Filtration von Nierenabfällen beteiligt sind, beginnen Sie mit der Einnahme einer Suspension von humanen IPSCs in einem Mesoderm-Induktionsmedium.

Übertragen Sie diese Suspension auf eine mit Kellermatrix beschichtete Kulturplatte und inkubieren Sie. Die Kellermatrix erleichtert die Verklebung von IPSCs an der Basis. Anschließend induzieren die spezifischen Faktoren, die in den Medien vorhanden sind, die Differenzierung von IPSCs in die Mesodermzellen, die Vorläuferzellen für Podozyten. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium.

Ergänzen Sie die Platte mit dem gewünschten Volumen eines intermediären Mesoderm-Induktionsmediums und inkubieren Sie für eine längere Zeit. Dieser Schritt führt zur Differenzierung der mesodermalen Zellen in unreife Podozyten. Ersetzen Sie das intermediäre Mesoderm-Induktionsmedium durch eine Trypsinlösung, um die adhärenten Zellen von der Platte zu dissoziieren.

Als nächstes zentrifugieren Sie, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand, der die Trypsinlösung und die Matrixfragmente enthält, ist zu verwerfen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Podozyten-Induktionsmedium. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine frisch beschichtete Kulturplatte. Inkubieren, um die Entwicklung mehrerer fußartiger Vorsprünge aus Zwischenzellen zu ermöglichen, was zur Bildung reifer Podozyten führt.

Nach der Zählung resuspendieren die Zellen auf eine Konzentration von 1 mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter Mesoderm-Induktionsmedium und aspirieren Sie die extrazelluläre Matrixlösung aus den mit Basalmembranmatrix 2 beschichteten Platten. Spülen Sie die Platten zweimal mit warmem Medium ab und mischen Sie die humaninduzierte pluripotente Stammzellsuspension durch sanftes Pipettieren.

Geben Sie 1 Milliliter Zellen in jede Vertiefung der Basalmembranmatrix 2-beschichteten 12-Well-Platten und schütteln Sie die Platten vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen. Legen Sie dann die Platte in den Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie an den Tagen 2 bis 15 der Differenzierung das Mesoderm-Induktionsmedium durch 1 Milliliter intermediäres Mesoderm-Induktionsmedium pro Well.

Wenn ein erhebliches Zellwachstum und eine schnelle Erschöpfung der Nährstoffe beobachtet wird, was durch eine Vergilbung des Mediums angezeigt wird, kann das Volumen des intermediären Mesoderm-Differenzierungsmediums auf 1,3 Milliliter pro Vertiefung erhöht werden. Am Tag 16 der Kultur spülen Sie die intermediären Mesodermzellen mit warmem Medium und inkubieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,05 % Trypsin-EDTA pro Vertiefung für 3 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Wenn die Zellen zu dissoziieren beginnen, kratzen Sie die Zellen mit einem Zellheber ab und mischen Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren. Stoppen Sie die Reaktion mit etwa 2 Millilitern Trypsin-Neutralisationslösung pro Vertiefung und geben Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Bringen Sie das Volumen mit Medium auf 50 Milliliter und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das Pellet und das Podozyten-Induktionsmedium in einer Konzentration von 1 mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter des Mediums und geben Sie die Zellen zu Basalmembran-Matrix-2-beschichteten Platten. Schütteln Sie dann die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen, und legen Sie die Zellen für bis zu 5 Tage in den Inkubator.

• Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Reprogrammed mature cells with a proliferative, undifferentiated state similar to stem cells.
• Podocytes - Specialized cells involved in the filtration of waste from kidneys.
• Mesoderm Cells - Precursor cells for podocytes that are derived from IPSCs.
• Mature Podocytes - Fully developed podocytes, characterized by several foot-like projections.
• Directed Differentiation - A process of driving the development of undifferentiated cells into a specific cell type.

• Introduce Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) - Cells which can be reprogrammed to regain a stem cell-like state (e.g., pluripotent).
• Key Concepts - Summarization of the steps from IPSCs to mature podocytes (e.g., directed differentiation of IPSCs, kidney mesoderm).
• Underlying Mechanisms - This involves various elements, such as media induction, cell incubation, and resuspension (e.g., deriving).
• Connect to Experiment - Understanding of how this process is valuable in studying kidney functions (e.g., podocytes kidney, normal human kidney podocytes).

• What are Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs) and how are they reprogrammed?
• What are podocytes and how do they function in the kidney?
• What is the process of deriving podocytes from mesoderm cells?

• Practical Applications - Generation of podocytes could be used in testing pharmaceutical effects on kidneys (e.g., kidney podocytes).
• Industry Impact - The research may offer new treatments for kidney-related diseases (e.g., human podocytes).
• Societal Importance - A better understanding of the IPSCs may revolutionize regenerative medicine (e.g., pluripotent).
• Link to Scientific Advancements - The evolution of technology that could manipulate cell development (e.g., directed differentiation of ipsc).