Glomeruli-Isolierung: Eine Technik zur Gewinnung intakter Glomeruli aus der Murine
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 3:35 Min. • April 30th, 2023
In den Nieren von Wirbeltieren bestehen die Nephrone aus mehreren Glomeruli - einem dichten Netzwerk von Blutgefäßen -, die eine Hauptrolle bei der Filterung von Abfallstoffen aus dem Körper spielen.
Um Glomeruli zu isolieren, beginnen Sie mit der Entnahme einer frisch präparierten Mausniere. Lösen Sie mit einer Pinzette die Nierenkapsel von der Niere ab und legen Sie die saubere Niere in eine neue Kulturschale. Stellen Sie nun die Schale auf Eis, um eine Nierendegradation zu vermeiden. Die Niere in kleine Stücke hacken.
Anschließend werden die zerkleinerten Nierenstücke in einer geeigneten Pufferlösung wieder suspendiert. Filtrieren Sie die Gewebesuspension durch einen großformatigen Netzfilter und sammeln Sie den Durchfluss in einer frischen Schale. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einige Male, während Sie die Maschenöffnung jedes Mal schrittweise verringern, bis sich die Glomeruli von den Nierenfragmenten dissoziieren.
Waschen Sie abschließend den Filter mit dem gewünschten Nährmedium, um die kleineren eingeschlossenen Glomeruli aufzufangen, während die Nierenfragmente im Filtrat verbleiben. Übertragen Sie die Glomeruli auf eine extrem niedrige Befestigungsplatte. Visualisieren Sie die Platte mit einem inversen Lichtmikroskop.
Erfassen Sie mit Hilfe einer Mikropipette einen einzelnen Glomerulus und übertragen Sie ihn in eine frische Vertiefung. Ergänzen Sie die Vertiefung mit Nährmedien und verwenden Sie den isolierten Glomerulus für die weitere Analyse.
Nachdem Sie die Nieren wie im Textmanuskript beschrieben befreit haben, halten Sie die Niere mit der chirurgischen Zange fest und ziehen Sie mit einer weiteren Pinzette die Nierenkapseln ab. Legen Sie danach die Nieren in die Vertiefungen einer 6-Well-Kulturplatte, die jeweils 2 Milliliter HBSS enthalten, und stellen Sie die Kulturplatte auf Eis.
Übertragen Sie dann die Nieren in eine 100-Millimeter-Petrischale und hacken Sie sie mit zwei Skalpellen in kleine Stücke, die etwa 1 bis 2 Millimeter groß sind. Halten Sie die gehackten Nierenstücke mit HBSS feucht.
Legen Sie dann die Nierenstücke auf ein 300-Mikrometer-Metallsieb und drücken Sie die Niere mit dem Kolben einer 20-Milliliter-Spritze durch das Sieb. Spülen Sie das Sieb zwischendurch immer wieder mit HBSS aus und verwenden Sie eine serologische Pipette, um den Durchfluss aufzufangen und in eine saubere Petrischale zu übertragen.
Kratzen Sie mit einem Skalpell alles ab, was am Boden des Siebs übrig geblieben ist, und geben Sie es in das gesammelte Nierenhomogenat. Spülen Sie das Nierenhomogenat durch ein 75- und ein 53-Mikrometer-Sieb mit HBSS. Waschen Sie dann beide Siebe mit HBSS, um alle kleineren Strukturen zu entfernen.
Sammeln Sie die Nierenstrukturen und das Material, das in den Sieben verbleibt, indem Sie die Oberseite jedes Siebs mit DMEM waschen, das mit 20 % fötalem Kälberserum angereichert ist, und übertragen Sie das Material in die Vertiefungen einer 6-Well-Mikroplatte mit ultraniedriger Bindung.
Bringen Sie die Mikrotiterplatte mit extrem niedrigem Aufsatz an ein inverses Lichtmikroskop und verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Pipette, um einzelne verkapselte und/oder entkapselte Glomeruli zu sammeln.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung von Glomeruli aus Mausniere beschrieben, die für die Untersuchung der Nierenfunktion und -pathologie unerlässlich sind. Das Verfahren umfasst eine sorgfältige Dissektion, Zerkleinerung und Filtration von Nierengewebe, um reine Glomeruli für weitere Analysen zu gewinnen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nephrologie
- Zellbiologie
- Nierenphysiologie
Hintergrund
- Glomeruli sind entscheidende Strukturen in der Niere, die für die Blutfiltration verantwortlich sind.
- Das Verständnis der Glomerulusfunktion ist entscheidend, um Nierenerkrankungen zu erforschen.
- Die Isolierung von Glomeruli ermöglicht eine detaillierte Untersuchung ihrer zellulären und molekularen Eigenschaften.
- Aktuelle Methoden zur Isolierung von Glomeruli können komplex sein und erfordern Präzision.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Isolierung von Glomeruli aus Mausniere bereitstellen.
- Die Forschung zur Nierenfunktion und zu Krankheitsmechanismen unterstützen.
- Das Verständnis der glomerulären Biologie durch verbesserte Isolationsverfahren vertiefen.
Verwendete Methoden
- Präparation der Mausniere und Entfernung der Nierenkapseln.
- Zerkleinerung des Nierengewebes in kleine Fragmente.
- Sequentielle Filtration durch Netzfilter zur Isolierung der Glomeruli.
- Verwendung von Kulturmedien zur Aufrechterhaltung isolierter Glomeruli.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Glomeruli mit minimaler Kontamination durch Nierenfragmente.
- Visuelle Bestätigung der isolierten Glomeruli mittels invertierter Lichtmikroskopie.
- Entwicklung einer reproduzierbaren Methode zur Isolierung von Glomeruli.
- Möglichkeit zur weiteren Analyse der isolierten Glomeruli in verschiedenen experimentellen Ansätzen.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode bietet einen wirksamen Ansatz zur Isolierung von Glomeruli.
- Diese Technik kann dazu beitragen, die Forschung in der Nierenbiologie und -pathologie voranzutreiben.
- Zukünftige Studien können isolierte Glomeruli für verschiedene experimentelle Analysen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung intakter Glomeruli aus murinen Nieren ermöglicht eine mechanistische Entlastung bei der Nierenzielvalidierung, indem ein gereinigtes System bereitgestellt wird, um Signalwege in parietalen epithelialen Zellen zu untersuchen. Dieser Ansatz stärkt das Vorhersagevertrauen in der frühen Entdeckungsphase, indem biologisches Rauschen durch kontaminierendes Nierengewebe reduziert wird, wodurch die Reproduzierbarkeit von Assays für screeningsbasierte Untersuchungen von Signalwegen verbessert wird. Die Methode unterstützt translationale Biomarker-Bemühungen in der Nephrologie und bietet ein krankheitsrelevantes System zur Verfeinerung präklinischer Modelle.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung glomerulusspezifischer Signalwege, wie beispielsweise der Aktivierung parietaler epithelialer Zellen, zur Validierung renaler Zielstrukturen mit reduzierter mechanistischer Uneindeutigkeit.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares Isolierprotokoll, das die Variabilität durch Kontamination mit Nierenfragmenten minimiert und somit konsistente Nachweise der Zielstrukturen ermöglicht.
- Translationeller Wert: Erzeugt gereinigte Glomeruli, die für die Kultivierung krankheitsrelevanter Zellauswüchse geeignet sind und somit die Hypothesenprüfung in einem kontrollierten ex vivo-System erleichtern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt intakte, verkapselte und entkapselte Glomeruli, die ihre native Architektur bewahren, und ermöglicht dadurch eine zuverlässige Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf das Verhalten glomerulärer Zellen.
- Operativer Wert: Liefert Glomeruli, die mit Platten mit ultra-niedriger Anhaftung kompatibel sind, und standardisiert so die Kulturbedingungen für skalierbare Screening-Workflows.
- Translationeller Wert: Unterstützt die Bereitschaft der Assays für nachgeschaltete Anwendungen wie Arzneimittelprüfung und Krankheitsmodellierung, indem kontaminationsfreie Glomeruli-Präparationen bereitgestellt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Etabliert ein krankheitsrelevantes System zur Untersuchung der glomerulären Pathophysiologie und verbindet entdeckte Befunde mit der präklinischen Validierung in murinen Modellen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die longitudinale Analyse isolierter Glomeruli unter kontrollierten Kulturbedingungen und verbessert so die Datenkonsistenz zwischen präklinischen Studien.
- Translationeller Wert: Erleichtert die Abstimmung von Biomarkern, indem molekulares Profiling von Parietalepithelzellen in einem gereinigten glomerulären Kontext ermöglicht wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess ein, indem sie gereinigte Glomeruli für Target-Validierungsassays bereitstellt, die die Leitstruktur-Identifizierung anhand wegweisspezifischer Messgrößen unterstützen und die präklinische Kontinuität durch standardisierte Glomerularpräparationen gewährleisten.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung glomerulärer Signalwege, indem Glomeruli frei von tubulären Verunreinigungen isoliert werden, wodurch zielgerichtete Mechanismen geklärt werden können.
- Screening: Stellt Glomeruli bereit, die für quantitative zelluläre Auswuchsassays geeignet sind, und verbessert so die Reproduzierbarkeit bei Wirkstoffscreening-Kampagnen.
- Analytik: Ermöglicht die Visualisierung und Gewinnung einzelner Glomeruli mittels inverser Mikroskopie und liefert damit definierte Einheiten für standardisierte molekulare oder phänotypische Messungen.
- Translationale Forschung: Verbindet isolierte Glomeruli mit der präklinischen Kontinuität, indem ein gereinigtes System bereitgestellt wird, um die Zielmodulation in einem nierenrelevanten Kontext zu bewerten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Isolationsplattform, die auf mehrere glomeruläre Zielstrukturen und Krankheitsmodelle anwendbar ist und somit redundante Protokollentwicklungen reduziert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem störende Signale aus nicht-glomerulären Nierengeweben eliminiert werden.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung durch sequenzielle Filtrations- und Waschschritte sicher und verbessert so die Übertragbarkeit von Glomeruli-Präparationen zwischen verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien, indem eine frühzeitige Risikominimierung für renale Zielstrukturen in einem physiologisch relevanten System ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem klarere mechanistische Endpunkte aus isolierten glomerulären Systemen bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrochirurgischer Dissektion und steriler Gewebehandhabung, um die Integrität der Glomeruli während der Isolierung aufrechtzuerhalten.
- Setzt den Zugang zu Sieben mit abgestuften Porengrößen (300, 75, 53 Mikrometer) und Kulturplatten mit niedriger Anheftungsneigung für eine effektive Trennung und Kultivierung voraus.
- Erfordert standardisierte Puffer auf Basis von HBSS und DMEM über alle Arbeitsgruppen hinweg, um eine konsistente Ausbeute und Vitalität der Glomeruli sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf verschiedene murine Stämme oder Krankheitsmodelle angewendet wird, die die Größe oder Fragilität der Glomeruli beeinflussen.
- Ist durch die Notwendigkeit manueller Auswahl der Glomeruli unter dem Mikroskop begrenzt, was die Durchsatzkapazität bei Hochdurchsatz-Screenings ohne Integration von Automatisierung einschränken kann.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026