Reverse-Phase-Protein-Arrays-basierte Proteinexpressionsanalyse: Ein Verfahren zur gleichzeitigen Quantifizierung der Expression mehrerer Proteine aus Zelllysat

Eine Tumorprobe enthält eine heterogene Population von Proteinen. Mit Hilfe von Tumorlysat können mehrere solcher Proteine parallel analysiert werden, um das interessierende Protein zu identifizieren. Diese Hochdurchsatztechnik wird als Reverse Phase Protein Arrays oder RPPA bezeichnet.

Um RPPA durchzuführen, beginnen Sie mit der Entnahme eines mit Nitrocellulose beschichteten Immunoassay-Objektträgers. Erkennen Sie eine Anordnung von Tumorlysatproteinen auf dem Objektträger. Inkubieren, um die Proteineinfangung auf Nitrocellulose zu ermöglichen. Behandeln Sie den Objektträger anschließend mit einem Blockierungspuffer, der unspezifische Antikörperbindungsstellen auf Proteinen blockiert.

Entfernen Sie die überschüssige Blocklösung. Montieren Sie nun den proteinbeschichteten Objektträger in einer Halterung und verschließen Sie diese fest. Dadurch entstehen temporäre Vertiefungen über der Rutschfläche. Beladen Sie anschließend die Wells mit einer primären Antikörperlösung. Diese Antikörper erkennen Epitope, die auf dem entsprechenden Ziel vorhanden sind, aus einer Mischung von Proteinen auf dem Array.

Fügen Sie abschließend fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper hinzu. Diese Antikörper binden an die vorgebundenen Primärantikörper und bilden einen Komplex. Waschen Sie den Objektträger, um ungebundene Sekundärantikörper zu entfernen. Lösen Sie die Folie von der Halterung und lassen Sie sie an der Luft trocknen.

Scannen Sie das Objektträger mit einem Fluoreszenzscanner. Die mit Antikörpern markierten Zielproteine fluoreszieren bei einer bestimmten Wellenlänge und erscheinen als farbige Flecken auf der Objektträgeroberfläche.

Vor dem RPPA-Druck wird von jeder Probe eine Reihe von fünf zweifachen Verdünnungen vorgenommen. Einer der zeitaufwändigsten Aspekte dieses Verfahrens ist die Herstellung von Hunderten von Verdünnungen. Ein erfolgreiches Ergebnis kann durch eine doppelte Überprüfung vor dem Drucken von Objektträgern sichergestellt werden.

Ein MicroGrid II-Roboter-Spotter wird dann verwendet, um Proteinlysate auf Nitrozellulose-beschichteten Glasobjektträgern zu erkennen. Jede Probe wird in dreifacher Ausfertigung gefleckt, was zu insgesamt 15 Flecken pro Probe führt. Die Objektträger, die in diesem Experiment verwendet werden, enthalten zwei Pads, auf die die Proben gefleckt werden. Jedes Pad wurde mit identischen Proben gesichtet, in diesem Fall 100 Proben. Weitere verfügbare Formate sind 1-, 8- und 16-Block-Folien. Je höher die Anzahl der Pads, desto geringer ist die Anzahl der Proben, die auf jedem Pad entdeckt werden können.

Um mit dem Verfahren zum Proteinnachweis zu beginnen, werden die Objektträger in überschüssigem Blockierungspuffer nass genommen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Wippplattform inkubiert. 800 Mikroliter Primärantikörper in Blockierungspuffer in den gewünschten Konzentrationen vorbereiten und auf Eis legen. Nach der einstündigen Inkubation im Blockpuffer montieren Sie die Objektträger entweder in den Einzelrahmen-Chipclip oder in den FastFrame-Objektträgerhalter mit vier Schächten, so dass eine dichte Abdichtung zwischen dem Objektträger und der Inkubationskammer entsteht.

Entfernen Sie den Restpuffer aus den Wells und geben Sie 600 Mikroliter Primärantikörper in die entsprechenden Wells. Legen Sie die Objektträger und die Kammer in eine verschlossene Nassbox und inkubieren Sie über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einer Schaukelplattform. Am nächsten Morgen die Objektträger aus dem Kühlraum nehmen. Entfernen Sie vorsichtig die primären Antikörper aus jeder Vertiefung. Fügen Sie 600 Mikroliter 0,1 % PBS-Tween20 oder PBS-T hinzu und waschen Sie die Objektträger auf einer Schaukelplattform bei Raumtemperatur für 5 Minuten.

Ersetzen Sie das PBS-T durch frisches PBS-T. Auf diese Weise wird die Folie insgesamt dreimal gewaschen. Entfernen Sie den Puffer aus den Vertiefungen und geben Sie 600 Mikroliter fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper in der entsprechenden Verdünnung in die jeweiligen Vertiefungen. Inkubieren Sie mit Sekundärantikörpern 45 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Es ist wichtig, die Membran bis zum Zeitpunkt des Scannens vor Licht zu schützen. Entfernen Sie nach 45 Minuten Sekundärantikörper aus den Vertiefungen und waschen Sie sie dreimal kurz in 600 Mikrolitern PBS-T bei Raumtemperatur.

Nehmen Sie die Objektträger aus dem Träger, geben Sie sie in einen geeigneten Behälter und waschen Sie überschüssiges PBS-T 15 Minuten lang, wobei Sie die Membran im Dunkeln halten. Entfernen Sie PBS-T und waschen Sie die Membran 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS, um Tween20-Reste zu entfernen, wobei die Membran wieder im Dunkeln bleibt. Trocknen Sie die Fastslides 10 Minuten lang in einem 50 Grad Celsius heißen Ofen. Zum Schluss scannen Sie die Objektträger bei 680 Nanometern und/oder 800 Nanometern, je nachdem, welche Sekundärantikörper verwendet werden.