Reverse-Phase-Protein-Arrays-basierte Proteinexpressionsanalyse: Ein Verfahren zur gleichzeitigen Quantifizierung der Expression mehrerer Proteine aus Zelllysat

Eine Tumorprobe enthält eine heterogene Population von Proteinen. Mit Hilfe von Tumorlysat können mehrere solcher Proteine parallel analysiert werden, um das interessierende Protein zu identifizieren. Diese Hochdurchsatztechnik wird als Reverse Phase Protein Arrays oder RPPA bezeichnet.

Um RPPA durchzuführen, beginnen Sie mit der Entnahme eines mit Nitrocellulose beschichteten Immunoassay-Objektträgers. Erkennen Sie eine Anordnung von Tumorlysatproteinen auf dem Objektträger. Inkubieren, um die Proteineinfangung auf Nitrocellulose zu ermöglichen. Behandeln Sie den Objektträger anschließend mit einem Blockierungspuffer, der unspezifische Antikörperbindungsstellen auf Proteinen blockiert.

Entfernen Sie die überschüssige Blocklösung. Montieren Sie nun den proteinbeschichteten Objektträger in einer Halterung und verschließen Sie diese fest. Dadurch entstehen temporäre Vertiefungen über der Rutschfläche. Beladen Sie anschließend die Wells mit einer primären Antikörperlösung. Diese Antikörper erkennen Epitope, die auf dem entsprechenden Ziel vorhanden sind, aus einer Mischung von Proteinen auf dem Array.

Fügen Sie abschließend fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper hinzu. Diese Antikörp