Intravenöse Mikroinjektion von Nephrotoxinen in den Zebrafischembryo: Eine Technik zur Abgabe nephrotoxischer Wirkstoffe in den Blutkreislauf des Zebrafischembryos

Die intravenöse Mikroinjektion erleichtert die Verabreichung von Molekülen von Interesse in den Blutkreislauf eines Empfängertieres. Um Nephrotoxine in einen Zebrafischembryo zu bringen, bereiten Sie zunächst eine geeignete Konzentration der gewünschten Nephrotoxinlösung vor.

Laden Sie diese Nephrotoxinlösung mit einer feinen Gelladespitze in eine Mikroinjektionsnadel mit einer geschärften Eckspitze. Hängen Sie die Nadel vertikal auf, damit die Nephrotoxinlösung die Nadelspitze durch die Schwerkraft füllen kann. Befestigen Sie nun die geladene Mikroinjektionsnadel in der Halterung eines Mikromanipulators.

wird ein betäubter Zebrafischembryo in die vorgefertigte Mikrospritzgussform überführt. Richten Sie den Embryo in der Form so aus, dass der Kopf innerhalb der Vertiefung und der Schwanz aus der Vertiefung ausgerichtet ist, um die Zugänglichkeit zum Schwanz für die Mikroinjektion zu verbessern. Positionieren Sie dann die Nadelspitze genau in der Nähe des Embryos.

Injizieren Sie die Nephrotoxinlösung in die Schwanzvene des Embryos. Die injizierten nephrotoxischen Wirkstoffe verteilen sich im Kreislauf und erreichen entfernte Organe wie die Niere. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück. Übertragen Sie den Embryo in eine frische Schale mit Embryomedium und lassen Sie ihn sich erholen. Inkubieren Sie den Embryo für eine bestimmte Dauer.

Innerhalb weniger Stunden nach der Injektion reichern sich die Nephrotoxine in der Niere an und verursachen Schäden, die zu einer Verschlechterung der Nierenfunktion führen.

Bereiten Sie am Tag der Injektion die gewünschte Nephrotoxinlösung mit der entsprechenden Fahrzeugkontrolle vor. Vortexen oder sanft mischen. Überprüfen Sie anschließend die Seiten des Röhrchens und die Oberseite der Wassersäule, um sicherzustellen, dass die Arzneimittel in Lösung aufgelöst sind.

Laden Sie eine getrimmte Mikroinjektionsnadel mit 2 bis 3 Mikrolitern Nephrotoxin, indem Sie eine feine Gelladespitze in die Rückseite der Nadel einfädeln und die Nadel mit einem Stück Klebeband vertikal aufhängen, damit die Lösung die getrimmte Nadelspitze durch die Schwerkraft füllen kann.

Sobald die Nadelspitze voll ist, befestigen Sie die geladene Nadel im Mikromanipulator. Testen Sie das Mikroinjektionsvolumen, indem Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerobjektträger geben und in das Öl injizieren, um die Tröpfchengröße zu bestimmen.

Nehmen Sie als Nächstes die Schale mit den Embryonen aus dem Inkubator und betäuben Sie sie, indem Sie 5 Milliliter 0,2% Tricain in die Embryoschale geben. Anschließend übertragen Sie die Embryonen mit einer Transferpipette in die Spritzgießform. Manövriere jeden Embryo in eine andere Vertiefung der Form, indem du den Kopf in den tiefsten Bereich der Vertiefung legst, so dass der Rüssel entlang der Vertiefung aufliegt und der Schwanz aus der Vertiefung herausragt.

Führen Sie nun die gefüllte Nadel in den Mikromanipulator ein und positionieren Sie die Nadelspitze neben einem Embryo. Führen Sie die Nadel vorsichtig in die Schwanzvene ein, um sie zu mikroinjizieren.

Der kritischste Schritt des Verfahrens ist die Mikroinjektion. Um den Erfolg zu gewährleisten, muss die Nadel in einem spitzen Winkel geschnitten und vorsichtig in Position neben dem Embryo gebracht werden.

Wenn die Injektion erfolgreich ist, sollten Sie sehen, dass die Flüssigkeit in den Kreislauf gelangt. Die Co-Injektion des Nephrotoxinums mit fluoreszierend konjugiertem Dextran würde es dem Forscher ermöglichen, die erfolgreiche Injektion nach dem Eingriff zu überprüfen. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Nadel vom Embryo.

Übertragen Sie den Embryo in ein sauberes Geschirr und spülen Sie ihn mit frischem E3/PTU ab, um das Tricain zu entfernen. Inkubieren Sie dann den Embryo zum gewünschten Zeitpunkt, um die Morphologie zu beurteilen, die durch Fotografie in Methylcellulose-Einbettmedien dokumentiert werden kann, oder verfahren Sie wie gewünscht für die experimentelle Analyse.

Beachten Sie, dass die Genesung von Embryonen alle 12 bis 24 Stunden nach der Injektion beurteilt werden sollte, um den Prozentsatz der Personen mit Ödemen zu bestimmen, die häufig auf eine Nierenschädigung hinweisen.