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Krebsforschung
0 Aufrufe • 3:17 Min. • April 30th, 2023
Gliom-Stammzellen oder GSCs sind eine Subpopulation des Glioms - einer Krebserkrankung der Gliazellen im Gehirn.
Die Markierung dieser GSCs mit biolumineszierenden Enzymen wie Luciferase hilft bei der Etablierung von Hochdurchsatz-Bildgebungsassays für das Wirkstoffscreening.
Um mit Luciferase markierte GSCs herzustellen, beginnen Sie mit einer Kultur von GSCs in einem geeigneten Wachstumsmedium.
Zentrifugieren Sie die Kultur, um ein Zellpellet zu erhalten, und entfernen Sie den Überstand.
Fügen Sie dem Pellet geeignete Verdauungsenzyme hinzu. Diese Enzyme dissoziieren Zellverbände und bauen alle Spuren von Bindegewebe ab, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
Zentrifugieren Sie nun die einzellige Suspension und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Pellet in einem frischen Medium.
Als nächstes säen Sie die gewünschte Konzentration der Zellen in eine Kulturplatte.
Inkubieren Sie die Kultur und lassen Sie die Zellen an der Kulturplatte haften.
Anschließend wird der gewünschte Titer eines virushaltigen Genkonstrukts für Luciferase-verstärktes grün fluoreszierendes Protein oder EGFP hinzugefügt und inkubiert.
Das Virus interagiert mit den Oberflächenrezeptoren von GSCs und löst die Freisetzung von viraler RNA aus, die Luciferase-EGFP enthält. Zelluläre Enzyme katalysieren die reverse Transkription von RNA zu doppelsträngiger DNA und integrieren sie in das Genom von GSCs.
Bei der Visualisierung unter einem Fluoreszenzmikroskop erscheinen Luciferase-exprimierende Zellen aufgrund der von EGFP emittierten Fluoreszenz grün.
Beginnen Sie damit, die Gliom-Stammzellen oder GSCs aus dem Kulturmedium zu sammeln und sie bei 70 x g für 3 Minuten bei Raumtemperatur zu zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands verdauen Sie die Zellen 4 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Accutase.
Pipettieren Sie die Zellen mit einer 200-Mikroliter-Spitze wiederholt, um das Zellpellet zu dissoziieren und wieder zu suspendieren. Geben Sie die GSCs mit einer Dichte von 200.000 Zellen in 1 Milliliter Kulturmedium in jede Vertiefung einer 12-Well-Kulturplatte und inkubieren Sie sie über Nacht.
Geben Sie am nächsten Tag 30 Mikroliter Luciferase-EGFP-Virusüberstand in jede Vertiefung der Platte. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 2 Stunden bei 25 Grad Celsius und inkubieren Sie sie über Nacht.
Am nächsten Tag wird das Medium in den Vertiefungen wieder eingesetzt, indem die GSCs aufgefangen, zentrifugiert, der Überstand entfernt, in frischem Medium wieder suspendiert und neu beschichtet werden. Kultivieren Sie die Zellen für weitere 48 Stunden.
Beobachten Sie die Platte unter einem Fluoreszenzmikroskop und bestätigen Sie das Aussehen von GFP-positiven Zellen.