Kryokonservierung des Gehirns von Mäusen durch Einfrieren: Eine Technik zum schnellen Einfrieren ganzer Mäusehirnproben für die histologische Analyse
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 2:37 Min. • April 30th, 2023
Um murine Gehirnproben durch Schockfrosten zu kryokonservieren, nehmen Sie zunächst ein mit Isopentanlösung - einer hochleitfähigen Flüssigkeit - gefülltes Becherglas und tauchen Sie es in ein Glas mit flüssigem Stickstoff.
Frieren Sie das Isopentan ein, bis die Lösung zähflüssig wird.
In der Zwischenzeit nehmen Sie eine ganze Maushirnprobe mit Präfix in Saccharoselösung. Diese Behandlung verhindert eine Verformung des Hirngewebes in den nachfolgenden Schritten.
Entnehmen Sie die Gehirnprobe aus der Saccharoselösung und tupfen Sie sie trocken, um alle Spuren von Saccharose zu entfernen.
Positionieren Sie als Nächstes das Gehirn in der gewünschten Ausrichtung in einem tiefen Kryomold, der eine Schicht aus Einbettungsmedium enthält.
Überlagern Sie das Gehirn mit mehr Einbettungsmedien in der Kryomolde, um sicherzustellen, dass das gesamte Organ bedeckt ist.
Tauchen Sie dann das Kryomold mit dem eingebetteten Gehirn in das vorgekühlte Isopentanbad. Die schnelle Abkühlung des Hirngewebes auf eine extrem niedrige Temperatur gewährleistet den Erhalt der Gehirnarchitektur ohne jegliche Verzerrung.
Lassen Sie nun die Gehirnprobe einfrieren, bis sich das Einbettungsmedium verfestigt und eine gallertartige Schicht um das Gehirn bildet, die es an Ort und Stelle hält.
Nach dem Einfrieren nehmen Sie das Kryomold aus dem Isopentanbad und wickeln Sie das kryokonservierte Mäusegehirn in eine Folienfolie ein.
Lagern Sie die Probe bei minus achtzig Grad Celsius für die weitere histologische Analyse.
Zur Vorbereitung der Kryokonservierung füllen Sie ein Glas mit kaltem Isopentan/2-Methylbutan und stellen das Glas in ein mit flüssigem Stickstoff gefülltes Gefäß. Während das Lösungsmittel abkühlt, tupfen Sie das Gehirn auf einem Stück Filterpapier trocken und legen Sie das Gehirn in einen beschrifteten Kryomold.
Geben Sie vorsichtig etwa 5 Milliliter Schneidmedium mit optimaler Temperatur in die Mitte des Kryomolds und setzen Sie das Gehirn in der gewünschten Ausrichtung in die Form ein. Legen Sie das Kryomold mit einer sauberen Pinzette schnell für 30 bis 40 Sekunden in das gekühlte Isopentan/2-Methylbutan.
Sobald das Schneidmedium erstarrt ist, übertragen Sie das Kryomold auf Trockeneis und wickeln Sie das Kryomold und das schockgefrorene Hirngewebe für eine Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in Aluminiumfolie ein.
Übersicht
In diesem Artikel wird das Verfahren zur Kryokonservierung von murinen Gehirnproben mittels Schnellgefriertechnik beschrieben. Die Methode gewährleistet die Erhaltung der Gehirnarchitektur für nachfolgende histologische Analysen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Histologie
- Kryokonservierungstechniken
Hintergrund
- Die Konservierung von Gehirngewebe ist entscheidend für genaue histologische Untersuchungen.
- Das Schnellschockgefrieren verhindert die Verformung von Gehirnproben.
- Isopentan wird aufgrund seiner hohen Wärmeleitfähigkeit während des Gefriervorgangs verwendet.
- Einbettungsmittel tragen zur Stabilisierung des Gehirns während des Gefrierens bei.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Kryokonservierung von Maushirnproben zu etablieren.
- Die Integrität der Gehirnarchitektur für zukünftige Analysen zu bewahren.
- Einen detaillierten Protokollablauf für Forscher in der Neurowissenschaft bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer Isopentanlösung in flüssigem Stickstoff.
- Vorfixierung von Gehirnproben in Saccharoselösung zur Verhinderung von Verformungen.
- Einbetten von Gehirnproben in Kryokassetten mit Schneidmedium.
- Schnelle Abkühlung in Isopentan, um ultratiefe Temperaturen zu erreichen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erhaltung der Gehirnarchitektur nach Kryokonservierung.
- Entwicklung eines reproduzierbaren Protokolls für das Schnellschockgefrieren.
- Nachweis der effektiven Anwendung von Isopentan zur schnellen Abkühlung.
- Probenvorbereitung für die histologische Analyse bei -80 °C.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebene Methode eignet sich zur Kryokonservierung muriner Gehirnproben.
- Ein sachgemäßer Umgang und eine sorgfältige Vorbereitung sind entscheidend für die Probenechtheit.
- Dieses Protokoll kann Forschern in den Bereichen Neurowissenschaften und Histologie helfen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Durch die Kryokonservierung von murinem Hirngewebe mittels Schnellschockgefrierung wird eine hochauflösende histologische Analyse ermöglicht, da die native Gewebearchitektur erhalten bleibt. Diese Technik unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Entwederung von Risiken in der neurowissenschaftlichen Arzneimittelforschung, indem sie verlässliche morphologische Endpunkte sicherstellt. Sie trägt einer zentralen Anforderung an eine reproduzierbare Probenvorbereitung in präklinischen Studien mit Hirngewebe Rechnung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch erhaltene Gehirnmorphologie für Target-Engagement-Studien.
- Operativer Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem die Gewebestruktur während der histologischen Aufarbeitung erhalten bleibt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete räumliche und molekulare Analyseverfahren vor.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch konsistente Gewebepräservierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme, indem die native Gehirnstruktur für die präklinische Bewertung erhalten bleibt.
- Operativer Wert: Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung mit minimaler Probenveränderung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Target-Validierung bis zur präklinischen Forschung ein, wobei die histologische Integrität über Go/No-Go-Entscheidungen informiert.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen, indem der anatomische Kontext für die Analyse erhalten bleibt.
- Screening: Ermöglicht die Versuchsbereitschaft durch standardisierte, verformungsfreie Gewebepräparation.
- Analytik: Liefert quantitative morphologische Ergebnisse, die Teams bei dem Vergleich experimenteller Bedingungen unterstützen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem die Gewebetreue für Biomarker-Korrelationsstudien bewahrt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Kapazität in verschiedenen Neurowissenschaftsprojekten, die histologische Konsistenz erfordern.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung durch Verringerung histologischer Artefakte.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Gehirngewebeprotektion.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und reduziertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen neurowissenschaftlicher Programme.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen basierend auf zuverlässigen histologischen Daten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Histologie und Kryokonservierungstechniken.
- Setzt Zugang zu flüssigem Stickstoff, Isopentan und Kryoschablonen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Teams hinweg, um eine konsistente Probennahme zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungen je nach unterschiedlichen Hirnregionen oder Orientierungen.
- Ist durch die Notwendigkeit einer schnellen Durchführung begrenzt, um ein Auftauen während des Transfers zu verhindern.
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026