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Um spezifische Zellpopulationen in einem heterogenen Hirntumorgewebe der Maus für ihre anschließende Isolierung zu differenzieren, beginnen Sie mit der Entnahme eines Objektträgers mit dem kryokonservierten Hirntumorgewebeausschnitt von Interesse.
Inkubieren Sie das Gewebe nacheinander in abnehmenden Ethanolkonzentrationen. Ethanol löst das Einbettungsmedium, das in das Gewebe eingedrungen ist, und fixiert das Gewebe, während die Integrität der Nukleinsäure erhalten bleibt.
Zusätzlich rehydriert Ethanol das Gewebe, so dass in den nachfolgenden Schritten eine gleichmäßige Färbung möglich ist.
Behandeln Sie nun das Gewebe mit Cresylviolett. Cresylviolett - ein basischer Farbstoff - färbt saure zelluläre Bestandteile wie Nukleinsäuren.
Danach wird das Gewebe mit Eosin Y gegengefärbt. Eosin Y - ein saurer Farbstoff - färbt grundlegende zelluläre Bestandteile wie zytoplasmatische Proteine.
Dieser Schritt der differentiellen Färbung hilft bei der Unterscheidung zwischen dem Zytoplasma und anderen zellulären Strukturen und ermöglicht die Identifizierung von Zellen, die von Interesse sind.
Tauchen Sie das Gewebe nach der Färbung in steigende Konzentrationen von Ethanol, um das Gewebe zu dehydrieren und eine übermäßige Gewebeverzerrung zu vermeiden.
Waschen Sie anschließend das Tuch mit Xylol. Xylol verdrängt und entfernt Ethanol aus dem Gewebeschnitt.
Zum Schluss tragen Sie eine geeignete Befestigungslösung auf den Gewebeschnitt auf, um die Gewebemorphologie zu erhalten.
Der aufbereitete Gewebeschnitt ist bereit für die Laser-Mikrodissektion - ein Verfahren, das eine präzise Isolierung bestimmter Zellen aus dem Gewebe ermöglicht.
Tauchen Sie die Objektträger in 30 Sekunden sequentielle absteigende Ethanol-Tauchgänge, gefolgt von einer 20-sekündigen Färbung mit kristallvioletter Lösung für 20 Sekunden und 5 Sekunden in 0,5%iger Eosin-Y-Lösung.
Am Ende der Eosin-Y-Inkubation die Objektträger mit Filterpapier trocken tupfen und in aufeinanderfolgenden aufsteigenden Ethanol-Immersionen dehydrieren. Spülen Sie die Objektträger nach dem 60-sekündigen Eintauchen in Ethanol 3 Minuten lang in einem Behälter mit Xylol.
Trocknen Sie anschließend die Objektträger 10 Sekunden lang auf einer RNase-freien Oberfläche bei Raumtemperatur, bevor Sie die Proben in ein mit RNase-freiem Wasser vorbereitetes Einbettmedium einbetten. Nach 10 bis 20 Sekunden übertragen Sie die Objektträger auf die Mikrodissektionsplattform des Mikroskops.