JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 4:00 Min. • April 30th, 2023
Die Ubiquitinierung von Proteinen ist gekennzeichnet durch die Zugabe von Ubiquitin - einem regulatorischen Mini-Protein - über seine Di-Glycin-Reste an die Lysinreste des Substratproteins. Dadurch entsteht eine Lysin-Glycin-Glycin-Bindung zwischen dem Substratprotein und Ubiquitin.
Um Ubiquitin-markierte Peptide zu isolieren, beginnen Sie mit der Einnahme einer Peptidmischung.
Behandeln Sie diese Peptide mit einem Endonuklease-Enzym-Cocktail. Während der Behandlung spalten die Enzyme Lys-C und Trypsin die ubiquitinylierten Peptide effizient am Argininrest, was zu Peptidfragmenten führt, die ein charakteristisches Diglycinmotiv enthalten.
Fügen Sie diese Peptidfragmente zu einer Aufschlämmung aus Antikörper-konjugierten Hydrogelkügelchen hinzu.
Diese Antikörper enthalten eine Diglycin-Erkennungsstelle, die ausschließlich an die ubiquitinylierten Peptide bindet und einen Peptid-Bead-Komplex bildet.
Zentrifuge zur Pelletierung ubiquitinylierter Peptid-Kügelchen-Komplexe. Entfernen Sie den ungebundenen, nicht ubiquitinylierten peptidhaltigen Überstand.
Laden Sie die Komplexe auf eine Filterbaugruppe. Zentrifuge, um den Puffer zu entfernen und peptidkonjugierte Kügelchen einzufangen.
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