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Die Ubiquitinierung von Proteinen ist gekennzeichnet durch die Zugabe von Ubiquitin - einem regulatorischen Mini-Protein - über seine Di-Glycin-Reste an die Lysinreste des Substratproteins. Dadurch entsteht eine Lysin-Glycin-Glycin-Bindung zwischen dem Substratprotein und Ubiquitin.
Um Ubiquitin-markierte Peptide zu isolieren, beginnen Sie mit der Einnahme einer Peptidmischung.
Behandeln Sie diese Peptide mit einem Endonuklease-Enzym-Cocktail. Während der Behandlung spalten die Enzyme Lys-C und Trypsin die ubiquitinylierten Peptide effizient am Argininrest, was zu Peptidfragmenten führt, die ein charakteristisches Diglycinmotiv enthalten.
Fügen Sie diese Peptidfragmente zu einer Aufschlämmung aus Antikörper-konjugierten Hydrogelkügelchen hinzu.
Diese Antikörper enthalten eine Diglycin-Erkennungsstelle, die ausschließlich an die ubiquitinylierten Peptide bindet und einen Peptid-Bead-Komplex bildet.
Zentrifuge zur Pelletierung ubiquitinylierter Peptid-Kügelchen-Komplexe. Entfernen Sie den ungebundenen, nicht ubiquitinylierten peptidhaltigen Überstand.
Laden Sie die Komplexe auf eine Filterbaugruppe. Zentrifuge, um den Puffer zu entfernen und peptidkonjugierte Kügelchen einzufangen.
Fügen Sie ein angesäuertes Reagenz hinzu, das den pH-Wert senkt und die Peptide aus den Kügelchen löst.
Die freien Peptide aus dem Filtrat zurückgewinnen. Laden Sie sie auf einen frischen Filter mit hydrophober Matrix. Die Peptide bleiben in der Matrix erhalten, während saure Salze weggespült werden.
Lösen Sie die Peptide mit einem geeigneten Lösungsmittel ab.
Übertragen Sie die ubiquitinylierten Peptide in ein frisches Röhrchen und trocknen Sie sie, um alle Spuren von Lösungsmittel zu entfernen.
Eine Charge von Antikörpern mit Ubiquitin-Restmotiv, die an Protein-A-Agarose-Bead-Slurry konjugiert sind, wird in sechs gleiche Fraktionen aufgeteilt. Löse die drei Peptidfraktionen gemäß den Anweisungen des Manuskripts auf und schleudere die Trümmer nach unten.
Die Überstände der drei Fraktionen werden zur Bead-Slurry gegeben, während die anderen drei Fraktionen auf Eis bleiben, und sie 2 Stunden lang bei 4 Grad Celsius auf einer Rotatoreinheit inkubieren.
Drehen Sie dann die Perlen nach unten. Den Überstand auf eine frische Charge Kügelchen überführen und die Inkubation mit den restlichen drei Bead-Slurry-Fraktionen wiederholen.
Lagern Sie die Überstände für die anschließende globale Proteomanalyse und übertragen Sie die Kügelchen auf 200-Mikroliter-Pipettenspitzen, die mit einem GF/F-Filterstopfen ausgestattet sind.
Füllen Sie die Spitzen in 1,5-Milliliter-Röhrchen, die mit einem Zentrifugenspitzenadapter ausgestattet sind, und waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 200 Mikrolitern eiskaltem IAP-Puffer, gefolgt von drei Wäschen mit eiskaltem, gereinigtem Wasser.
Schleudern Sie die Säulen zwischen den Wäschen 2 Minuten lang bei 200 x g herunter und achten Sie darauf, dass die Säule nicht trocken läuft. Nach der letzten Wäsche eluieren Sie die Peptide mit zwei Zyklen von 50 Mikrolitern 0,15 % TFA. Entsalzen Sie die Peptide mit einer C18-Stufenspitze und trocknen Sie sie mit Vakuumzentrifugation.