SDS-PAGE-basierte Extraktion von extrazellulären Vesikel-assoziierten Proteinen: Ein Verfahren zur Extraktion von Proteinen aus EVs und deren Vorbereitung für den In-Gel-Verdau

Nehmen Sie zunächst einen Schlauch mit intakten extrazellulären Vesikeln oder EVs.

Suspendieren Sie die EVs im gewünschten Volumen des Lysepuffers und beschallen Sie die Probe. Bei dieser Behandlung wird die EV-Membran lysiert und das genetische Material geschert, wodurch die Proteine in den Puffer freigesetzt werden.

Zentrifuge, um die Zelltrümmer und das gescherte genetische Material zu pelletieren. Sammeln Sie den Überstand, der verschiedene Proteine enthält.

Fügen Sie dem Proteinextrakt einen Ladefarbstoff hinzu und lassen Sie ihn auf einem SDS-PAGE-Gel laufen.

Weichen Sie das Gel in einer Färbelösung ein, damit die Farbstoffmoleküle Proteine binden können. Suchen Sie die gefärbte Bande, die das gewünschte Protein enthält, und entfernen Sie sie.

Schneiden Sie das farbige Band in kleine Stücke, um in den folgenden Schritten die Zugänglichkeit von Proteinen zu Enzymen zu verbessern. Übertragen Sie diese Stücke in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Fügen Sie eine Entfärbungslösung hinzu, die den färbenden Farbstoff entfernt. Entfernen Sie die verbrauchte Entfärbungslösung.

Fügen Sie eine Reduktionslösung hinzu. Inkubieren, damit das Reduktionsmittel die Disulfidbindungen im Protein spa