Fluoreszenzbasierter Transwell-Makrophagen-Attraktionsassay: Eine In-vitro-Methode zur Untersuchung der Tumor-Makrophagen-Interaktion durch chemisch induzierte Chemotaxis
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 3:05 Min. • April 30th, 2023
Als Reaktion auf bestimmte chemische Lockstoffe, die von soliden Tumoren freigesetzt werden, infiltrieren Immunzellen wie tumorassoziierte Makrophagen oder TAMs die soliden Tumore. Anschließend erleichtern diese TAMs die Tumorprogression.
Um die Wechselwirkungen zwischen TAMs und Tumorzellen in vitro zu untersuchen, beginnen Sie mit der Entnahme einer Multiwell-Platte mit einem membranösen Einsatz. Diese Anordnung trennt den Brunnen vorübergehend in zwei Kammern.
Geben Sie als Nächstes eine Suspension von TAMs in das obere Fach des Transwells.
Ergänzen Sie das untere Kompartiment des Transwells mit einem konditionierten Medium, das mit chemischen Lockstoffen angereichert ist, die von Tumorzellen abgesondert werden.
Inkubieren Sie die Platte für die gewünschte Zeit.
Während der Inkubation ziehen chemische Modulatoren TAMs an. Dies führt dazu, dass TAMs durch chemisch induzierte Chemotaxis über die poröse Insertmembran in das untere Kompartiment gelangen.
Entferne nun den Einsatz aus der Vertiefung. Das konditionierte Medium mit der migrantischen TAM-Population wird in eine geeignete Platte für die Fluoreszenzmessung überführt.
Behandeln Sie die Zellen mit einem Lysepuffer, der Fluoreszenzfarbstoff enthält. Dieser Puffer lysiert die Makrophagen. Schließlich binden die Farbstoffmoleküle an die Nukleinsäuren und erzeugen eine verstärkte Fluoreszenz.
Zum Schluss wird die Platte mit einem Fluoreszenzplatten-Reader abgetastet. Eine hohe Fluoreszenz zeigt die erfolgreiche Migration von Makrophagen durch chemisch induzierte Chemotaxis an.
Bringen Sie zunächst die notwendigen Materialien auf Raumtemperatur. Geben Sie 250 Mikroliter der vorbereiteten MV-4-11-Zellen zu jedem Einsatz. Geben Sie als Nächstes 400 Mikroliter des konditionierten Mediums oder nur des Mediums in die unteren Kammern der 24-Well-Platte, wobei Sie darauf achten, dass die Proben in dreifacher Ausfertigung hinzugefügt werden.
Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 4 Stunden. Klopfen Sie dann vorsichtig mit dem Einsatz an der Innenwand derselben Vertiefung und entsorgen Sie den Einsatz. Pipettieren Sie die Zellen in den Vertiefungen dreimal vorsichtig auf und ab, um sie zu mischen.
Übertragen Sie 225 Mikroliter dieser Zellsuspension in die Vertiefungen einer schwarzwandigen 96-Well-Platte, die für die Fluoreszenzmessung geeignet ist. Danach verdünnen Sie den CyQuant-Farbstoff mit 4x Lysepuffer im Verhältnis 1:75. Kurz vortexen und die Lösung herunterschleudern.
Übertragen Sie 75 Mikroliter dieser Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Lesen Sie mit einem Fluoreszenzplatten-Reader die Fluoreszenz ab und analysieren Sie die Daten, wie im Textprotokoll beschrieben.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Rolle von Tumorzell-assoziierten Makrophagen (TAMs) in soliden Tumoren und deren Migration als Antwort auf chemotaktische Lockstoffe. Der experimentelle Aufbau beinhaltet die Verwendung eines Transwell-Systems, um das Verhalten der TAMs in vitro zu beobachten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Onkologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- TAMs sind Immunzellen, die feste Tumore infiltrieren.
- Sie spielen eine bedeutende Rolle bei der Tumorprogression.
- Chemische Attraktanten, die von Tumoren freigesetzt werden, beeinflussen die Migration der TAMs.
- Das Verständnis des Verhaltens von TAMs kann Einblicke in Krebsbehandlungen liefern.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Tumormakrophagen (TAMs) und Tumorzellen.
- Beurteilung der Migration von Tumormakrophagen (TAMs) als Reaktion auf tumorassoziierte Signale.
- Entwicklung eines zuverlässigen in-vitro-Modells zur Untersuchung des Verhaltens von Tumormakrophagen (TAMs).
Verwendete Methoden
- Verwendung einer Transwell-Platte zur Trennung der Signale von TAMs und Tumorzellen.
- INKubation von TAMs mit konditioniertem Medium von Tumorzellen.
- Messung der TAM-Migration mittels Fluoreszenztechniken.
- Analyse der Daten zur Bestimmung der Wirksamkeit der Chemotaxis.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Migration von TAMs wurde durch die poröse Membran hindurch beobachtet.
- Fluoreszenzmessungen zeigten hohe Bewegungsaktivität der TAMs an.
- Die Methode demonstrierte effektiv eine chemisch induzierte Chemotaxis.
- Die Ergebnisse untermauern die Rolle von TAMs in tumoralen Mikroumgebungen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet einen Rahmen zur Erfassung der Dynamik von TAMs.
- Die Ergebnisse könnten zukünftige Strategien zur Krebsbehandlung beeinflussen.
- Das In-vitro-Modell kann für weitere Untersuchungen zu TAM-Interaktionen verwendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser Test ermöglicht die quantitative Messung der Chemotaxis von Makrophagen in Richtung tumorderivierter Signale und unterstützt die Zielvalidierung in der Immunonkologie, indem er die mit Tumormakrophagen vermittelten Tumorprogressionsmechanismen entrisst. Er liefert ein reproduzierbares in-vitro-Modell zur Untersuchung von Modulatoren der Makrophagenmigration und unterstützt so Strategien zur Identifizierung führender Wirkstoffe, die auf die Umprogrammierung der Tumormikroumgebung abzielen. Die fluoreszenzbasierte Detektion ermöglicht eine hohe Durchsatzkapazität sowie eine datentechnische Abstimmung zwischen entdeckungsorientierter Biologie und translationsmedizinischen Teams.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen bezüglich der Rekrutierungsmechanismen von TAMs in solide Tumore.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Chemokinrezeptoren oder Signalwegen als potenzielle Zielstrukturen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch Quantifizierung der Makrophagenmigration in Reaktion auf tumorbedingte Medien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte Makrophagen-Migrationsysteme für Wirkstoff-Screening-Kampagnen vor.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt fluoreszenzbasierte Messsignale, die proportional zur chemotaktischen Antwort sind, und ermöglicht dadurch die Analyse von Dosis-Wirkungs-Beziehungen.
- Plattform-Wiederverwendung: Anpassbar an verschiedene Tumorzelllinien und immunmodulatorische Wirkstoffe für zielunabhängige Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert humane Tumor-Makrophagen-Interaktionen unter Verwendung von konditioniertem Medium aus klinisch relevanten Zelllinien wie MV-4-11.
- Translationaler Kontinuität: Verbindet in-vitro-Befunde mit der präklinischen Validierung von TAM-modulierenden Therapeutika.
- Mechanistische Entwederung Klärt kausale Zusammenhänge zwischen von Tumoren freigesetzten Faktoren und der Infiltration von Makrophagen auf und verringert damit die Unsicherheit bezüglich der Zielinteraktion.
Pipeline- und Workflow-Integration
Positioniert den Assay im Entdeckungsprozess, der von der Target-Hypothese-Identifizierung über die Lead-Optimierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsunterstützung reicht, insbesondere für immunmodulatorische Wirkstoffe, die die Tumormikroumgebung beeinflussen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung chemotaktischer Signalwege und die biologische Entrisikobewertung von TAM-Zielen.
- Screening: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare Makrophagen-Migrationsassays mit quantitativen Fluoreszenz-Auswertungen.
- Analytik: Liefert normalisierte Signalausgaben, die Vergleiche zwischen Testbedingungen und Kontrollen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit präklinischen Modellen durch konsistente Auswertungen des TAM-Verhaltens.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als modulare Plattform, die in verschiedenen Onkologieprojekten zur Untersuchung stromal-immuner Wechselwirkungen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich TAM-gerichteter Mechanismen, indem die mechanistische Mehrdeutigkeit in Chemotaxis-Assays verringert wird.
- Operativer Wert: Stellt die Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays durch definierte Inkubationszeiten, dreifache Stichprobenahme und normalisierte Fluoreszenzdetektion sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert die Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Auswirkungen der Zielmodulation auf die Makrophagenmigration früh im Entdeckungsprozess quantifiziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf ihrer Fähigkeit, chemotaktische Reaktionen zu hemmen oder umzuleiten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, aseptischer Technik und fluoreszenzbasierter Quantifizierung.
- Benötigt Transwell-Einsätze, Fluoreszenz-Plattenlesegeräte und kompatible Lyse-Färbereagenzien wie CyQuant.
- Erfordert die Standardisierung der Zellansaatdichte, Inkubationsdauer und Reagenzienverhältnisse zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Wechsel zwischen primären Makrophagen, Zelllinien oder alternativen Tumormodellen.
- Eingeschränkt durch die Abhängigkeit von der Qualität des konditionierten Mediums und die Annahme, dass die Fluoreszenz direkt mit der Anzahl migrierter Zellen korreliert.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026