JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 2:54 Min. • April 30th, 2023
Beginnen Sie mit der Entnahme einer Multi-Well-Platte mit adhärenten Zellen.
Behandeln Sie diese Zellen mit einem Medium, das tritiiertes Thymidin - eine radioaktive Version von Thymidin - enthält, und inkubieren Sie.
Während der Inkubation bauen aktiv replizierende Zellen radioaktives Thymidin ein. Dieses Thymidin paart sich gegenüber Adenosin und erzeugt radioaktiv markierte DNA in proliferierenden Zellen.
Entfernen Sie die verbrauchten Medien aus den Vertiefungen. Fügen Sie einen Lysepuffer hinzu, um die Zellen zu lysieren und DNA in die Suspension freizusetzen.
Bereiten Sie die Montage des Zellharvesters vor, indem Sie die Sammelrohre des Harvesters über die Vertiefungen der Mikrotiterplatte legen.
Wenden Sie Saugdruck an, um die Aspiration von suspendierter DNA aus den Vertiefungen zu ermöglichen. Diese DNA lagert sich auf dem Filterpapier ab und bildet bestimmte Flecken.
Schneiden Sie die Filterpapierspalten mit DNA-Flecken aus. Übertragen Sie diese Chads einzeln in Szintillationsfläschchen.
Überlagern Sie das Filterpapier mit einem Szintillationscocktail. Stellen Sie das Fläschchen in einen Flüssigszintillationszähler.
Im Inneren des Zählers gibt die markierte DNA Energie durch radioaktiven Zerfall ab. Diese Energie wird von den Bestandteilen des Szintillationscocktails absorbiert. Schließlich beginnen die Cocktail-Komponenten, die Impulse zu übertragen, die wiederum vom Sensor absorbiert werden.
Die Menge der nachgewiesenen Radioaktivität bestimmt das Ausmaß der Zellteilung.
Platten Sie 100.000 Zellen in dreifachen Vertiefungen in einer 24-Well-Platte. Nach 46 Stunden wird tritiiertes Thymidin in das Kulturmedium gegeben und 2 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.
Dann, nachdem Sie das Medium entfernt haben, fügen Sie 300 Mikroliter vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen auseinander zu brechen und die DNA freizusetzen. Schalten Sie dann den Zellharvester ein und schalten Sie die Pumpe ein.
Legen Sie das Filterpapier in den Cell Harvester. Sammeln Sie die Röhrchen des Zellharvesters in einer leeren leeren Schale. Drücken Sie dann auf Vorwäsche, um das Filterpapier zu befeuchten. Legen Sie die Sammelröhrchen in die Probenvertiefungen und legen Sie los.
Verwenden Sie eine heiße Lichtquelle, um das Filterpapier zu trocknen, und ordnen Sie die entsprechenden Fläschchen auf dem Fach an. Stanzen Sie Papierblätter in die Fläschchen aus und geben Sie dann 2 Milliliter flüssigen Szintillationscocktail in jedes Fläschchen.
Inkubieren Sie die Fläschchen 1 Stunde lang im Szintillationszähler, bevor Sie die Maschine in Betrieb nehmen, um die Zählungen pro Minute jeder Probe zu erhalten, die die aktive DNA-Synthese widerspiegeln.