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Krebsforschung
0 Aufrufe • 4:02 Min. • April 30th, 2023
Neurosphären sind nicht-adhärente kugelförmige Aggregate von neuronalen Vorläuferzellen oder NPCs.
Wenn NPCs unter bestimmten adhärenten Kulturbedingungen plattiert werden, können sie spontan aus der Neurosphäre auswandern.
Um die Migrationsreaktion von NPCs zu beurteilen, bereiten Sie zunächst eine NPC-Suspension mit der gewünschten Dichte in einem geeigneten Medium vor.
Anschließend wird die Zellsuspension in eine medienhaltige Kulturplatte ausgesät und inkubiert.
Die spezifischen Wachstumsfaktoren in den Medien unterstützen die Vermehrung von Zellen. Darüber hinaus bleiben die Zellen durch das Fehlen eines Beschichtungssubstrats in Medien suspendiert, was es ihnen ermöglicht, 3D-Zellaggregate, sogenannte Neurosphären, zu bilden.
Wenn Sie die gewünschte Größe erreicht haben, sammeln Sie die Neurosphären.
Zentrifugieren Sie das Neurosphären-Pellet und resuspendieren Sie es in den verdünnten Medien.
Dann wird die Neurosphärensuspension in eine mit extrazellulärer Matrix beschichtete Platte mit verdünntem Medium plattiert und inkubiert.
Während der Kultur haften die Neurosphären an der extrazellulären Matrix.
Im Laufe der Zeit beginnen einige NPCs aufgrund der Bestandteile der extrazellulären Matrix, sich vom Kern der Neurosphäre zu entfernen.
Entfernen Sie nun das Medium und befestigen Sie die Zellen.
Nehmen Sie Phasenkontrastbilder der Neurosphären auf, die eine Zellmigration aufweisen.
Messen Sie mit einer geeigneten Software die Fläche der gesamten Neurosphäre und die innere Zellmasse.
Subtrahieren Sie schließlich die innere Zellmassenfläche von der gesamten Neurosphärenfläche, um die durchschnittliche NPC-Migration aus der Neurosphäre zu berechnen.
Um die Neurosphäre zu bilden, pipettieren Sie 1 Milliliter 100%iges Expansionsmedium in eine 35-Millimeter-Schale ohne jegliches Beschichtungssubstrat. Fügen Sie dann eine Million neuronale Vorläuferzellen in jede dieser Platten hinzu und inkubieren Sie die Platte 48 bis 96 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.
Um die Platte für die Migration der Neurosphären vorzubereiten, lösen Sie ECM-mimisches Gelaliquote in 6 Millilitern 30%igem Expansionsmedium auf. Geben Sie 1 Milliliter ECM-mimisches Gel mit 30 % Expansionsmedium in eine einzelne Vertiefung einer 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte dann 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Um die Neurosphären zu plattieren, sammeln Sie mit einer Pipette die Zellen im Medium aus der 35-Millimeter-Schale und übertragen sie in ein konisches Röhrchen. Drehen Sie dann das Röhrchen bei 100 x g, um die Neurosphären zu pelletieren. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 1 bis 3 Millilitern vorgewärmtem 30%igem Dehnmedium.
Pipettieren Sie anschließend 200 Mikroliter der resuspendierten Neurosphären in die 6-Well-Platte, die das ECM-mimische Gel mit 30 % Expansionsmedium enthält, und rocken Sie die Platte. Inkubieren Sie die Platte dann 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie das ECM-mimische Gel mit 30 % Expansionsmedium und fixieren Sie die Zellen dann 30 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd.
Um die Neurosphären zu analysieren, nehmen Sie Bilder mit Phasenkontrasteinstellungen bei 10-facher Vergrößerung auf. Verwenden Sie die NIH ImageJ-Software, um die durchschnittliche Migration der Neurosphären zu messen. Verwenden Sie auf ImageJ das Freihandlinienwerkzeug, um die äußere Kontur der Neurosphäre nachzuzeichnen.
Verwenden Sie dann die measure-Funktion, um die Spurfläche zu berechnen und die innere Zellmasse der Kugel zu verfolgen. Subtrahieren Sie die innere Zellmasse von der gesamten Neurosphärenfläche, um die durchschnittliche Migration zu quantifizieren.