Question 1

Warum erfolgt die Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit vor den Schritten mit hoher Geschwindigkeit bei der Isolierung von EVs?

Accepted Answer

Die Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit bei 500 × g pelletiert Zellen und Gewebefragmente, während extrazelluläre Vesikel im Überstand verbleiben, wodurch eine erste Entfernung von Verunreinigungen ohne Verlust der EVs ermöglicht wird. Dieser Schritt klärt das Homogenat vor der weiteren Aufreinigung und verbessert die Reinheit der nachfolgend gewonnenen EV-Populationen. Er ist entscheidend, um große Kontaminanten zu entfernen, die nachfolgende Zentrifugations- und Filtrationsschritte stören könnten.

Question 2

Wie trägt die Filtration durch einen 0,45-Mikrometer-Filter zur EV-Reinigung bei?

Accepted Answer

Die Filtration entfernt verbleibende apoptotische Körper und größere Vesikel, die in vorangegangenen Zentrifugationsschritten nicht pelletiert wurden, wodurch die Anreicherung der kleineren EV-Population erreicht wird. Dieser Schritt stellt sicher, dass nur EVs unterhalb von 0,45 µm zur Ultrazentrifugation übergehen, wodurch eine Kontamination durch größere Partikel vermieden wird. Er erhöht die Spezifität des endgültigen EV-Pellets, das nach der Zentrifugation bei 100.000 × g erhalten wird.

Question 3

Welchem Zweck dient das Wiederaufnehmen des EV-Pellets in einer 0,25-molaren Saccharoselösung?

Accepted Answer

Die Saccharoselösung erzeugt ein isotonisches Milieu, das dabei hilft, die Morphologie und strukturelle Integrität der extrazellulären Vesikel nach der Ultrazentrifugation zu bewahren. Dadurch wird ein osmotischer Schock verhindert, der die Vesikel während der Lagerung oder Handhabung beschädigen könnte. Die Aufrechterhaltung der Integrität der extrazellulären Vesikel ist entscheidend für funktionelle Nachweismethoden und die genaue Charakterisierung von Vesikelpopulationen.

Question 4

Warum ist es notwendig, die EV-Suspension bei 4 Grad Celsius zu lagern?

Accepted Answer

Die Lagerung bei 4 °C erhält die Stabilität der extrazellulären Vesikel (EVs) und verhindert deren Abbau oder Aggregation bis zur weiteren Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen. Diese Temperatur bewahrt die Integrität der Vesikel, ohne dass ein Einfrieren erforderlich ist, das die Membranstruktur beeinträchtigen könnte. Sie trägt zur Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten bei, indem sie eine konsistente und stabile EV-Präparation ermöglicht.

Question 5

Wie verbessert die mechanische Dissoziation mittels Dounce-Homogenisator die Gewinnung von EVs aus Gewebe?

Accepted Answer

Etwa 30 langsame Stöße in einem locker sitzenden Dounce-Homogenisator lösen das Gewebe nach der Inkubation sanft auf und setzen Zellen und extrazelluläre Vesikel in das Puffermedium frei. Dieser mechanische Schritt ergänzt die enzymatische Dissoziation, indem er die Gewebearchitektur abbaut, ohne übermäßige Scherkräfte auszuüben, die die extrazellulären Vesikel beschädigen könnten. Er gewährleistet eine effiziente Freisetzung der extrazellulären Vesikel aus dem interstitiellen Raum, während deren strukturelle Integrität für nachfolgende Analysen erhalten bleibt.

Extraktion extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Isolierung extrazellulärer Vesikel aus ganzen Gewebeproben mittels Differenzialzentrifugation

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