Isolierung von Gehirnzellen aus Zebrafischlarven: Eine Technik zur Gewinnung intakter Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Zebrafisch-Hirngewebe

Das Gehirn des Zebrafisches besteht aus Neuronen – Nervenzellen, die eine herausragende Rolle bei der Verarbeitung von Informationen spielen. Darüber hinaus umfasst es eine Population von unterstützenden Immunzellen, einschließlich Makrophagen und Mikroglia, die den interneuronalen Raum bewohnen.

Um all diese Arten von Gehirnzellen aus einem Zebrafisch zu isolieren, nehmen Sie zunächst anästhesierte Zebrafischlarven in eine Petrischale, die geeignete Medien enthält.

Visualisieren Sie den Zebrafisch unter einem Stereomikroskop und durchschneiden Sie die Larvenköpfe über dem Dottersack, um das Gehirn intakt zu halten.

Die herausgeschnittenen Köpfe in einen mit vorgekühltem Medium gefüllten Homogenisator geben und auf Eis legen. Niedrige Temperaturen helfen, den Abbau von Gehirnzellen zu verhindern.

Mit einem Stößel das Gehirngewebe des Zebrafisches homogenisieren. Die Homogenisierung zersetzt die extrazelluläre Matrix und leitet die Dissoziation von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia vom Hirngewebe ein.

In diesem Schritt wird auch das Myelin - eine lipidreiche Isolierschicht - von den Neuronen getrennt.

Passieren Sie das Homogenat durch ein Sieb, um große Zellklumpen einzufangen.

Zentrifugieren Sie das Filtrat, um die Zellen und Myelinscheidenfragmente zu pelletieren. Entsorgen Sie den rückstandshaltigen Überstand.

Resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Medium mit Dichtegradienten und überlagern Sie es mit einem Puffer.

Drehen Sie das Rohr mit niedriger Geschwindigkeit herunter. Die leichteren Myelinfragmente bilden eine deutliche Bande an der Grenzfläche zwischen dem Puffer- und dem Dichtegradientenmedium, während sich die dichteren Zellen am Boden absetzen.

Aspirieren Sie die oberen Schichten und resuspendieren Sie die Gehirnzellen in frischen Medien für die weitere Verwendung.

Fügen Sie 1,5 Milliliter 15 Millimolar Tricain pro 50 Milliliter Medium zu 50 Larven hinzu, um die Anästhesie vorzubereiten. Verwenden Sie dann eine 3-Milliliter-Pasteurpipette, um jeweils 10 Larven in eine 55-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die mit eiskaltem E3-Medium mit Tricain gefüllt ist, um sie endgültig zu betäuben.

Richten Sie unter einem Stereomikroskop 10 Larven in der Mitte der Petrischale aus. Dann werden die Larvenköpfe mit einer chirurgischen Schere über dem Dottersack durchtrennt.

Nehmen Sie mit einer 3-Milliliter-Pasteur-Pipette alle Köpfe auf und geben Sie sie mit so wenig Flüssigkeit wie möglich in einen Glashomogenisator auf Eis, der 1 Milliliter eiskaltes Medium A enthält.

Ersetzen Sie jede kleine Petrischale, die eiskaltes E3 plus Tricain enthält, alle 30 Minuten durch eine neue, um sicherzustellen, dass die Durchtrennung in kaltem E3 plus Tricain-Medium durchgeführt wird.

Setzen Sie das eiskalte Medium A wieder in den Glashomogenisator ein, wenn die Farbe zu verblassen beginnt. Sobald die gesamte Gruppe von Köpfen gesammelt wurde, nehmen Sie alle Medien A aus dem Glashomogenisator und ersetzen Sie sie durch 1 Milliliter frisches, eiskaltes Medium A.

Während der Homogenisator noch auf Eis ist, verwenden Sie einen dicht schließenden Stößel, um das Hirngewebe zu zerkleinern, indem Sie 40 Runden Zerkleinern und Umdrehungen für 3 bis 5 dpf Larven und 50 Runden für 7 und 8 dpf Larven durchführen.

Geben Sie dann 2 Milliliter Medium A in die Zellsuspension, um die Zellen zu verdünnen und ihre Ansammlung mit Myelin zu reduzieren. Beseitigen Sie die Zellagglomeration, indem Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb in ein kaltes 50-Milliliter-Falkenröhrchen auf Eis laufen lassen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.

Übertragen Sie 1 Milliliter Aliquots der Zellsuspension in kalte 1,5-Millimeter-Röhrchen und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 300 x g und 4 Grad Celsius. Entfernen Sie dann mit einer 10-Milliliter-Spritze mit der 23G x 1"-Nadel den Überstand.

Mit 1 Milliliter eiskaltem 22% Dichtegradientenmedium, sanft überlagert von 0,5 Millilitern eiskaltem 1x DPBS, resuspendieren Sie das Zellpellet sanft. Schleudern Sie die Röhrchen bei 950 x g ohne Pause und verlangsamen Sie die Beschleunigung bei 4 Grad Celsius für 30 Minuten.

Nach dem Spin verwerfen Sie das DPBS-Dichtegradientenmedium und das an der Grenzfläche eingeschlossene Myelin. Verwenden Sie dann 0,5 Millimeter Medium A mit 2 % NGS, um die Zellen zu waschen, und drehen Sie die Röhrchen bei 300 x g bei 4 Grad Celsius für 10 Minuten.

Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich und ziehen Sie dann die Zellpellets aus dem gleichen Versuchszustand zusammen in 1 Milliliter Medium A mit 2 % NGS.

Wenn die interessierenden Zellen ein fluoreszierendes Protein exprimieren, lassen Sie die Zellsuspension durch eine 35-Mikron-Zellsiebkappe laufen und überführen Sie sie in kalte 5-Milliliter-FACS-Röhrchen auf lichtgeschütztem Eis.