Generierung von induzierten neuralen Stammzellen (iNSCs) aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs): Ein auf dem Sendai-Virus basierendes Verfahren zur Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs

Um somatische Zellen in induzierte neurale Stammzellen oder iNSCs umzuprogrammieren - Stammzellen mit hoher Selbsterneuerungs- und Differenzierungsfähigkeit, beginnen Sie mit der Kultivierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes in einem serumfreien Medium, um Erythroblasten zu expandieren.

Pipettieren Sie anschließend die Erythroblastensuspension in eine Kulturplatte. Behandeln Sie die Zellen mit rekombinanten Sendai-Viren oder SeV. Diese Viren kodieren für die Reprogrammierung von Transkriptionsfaktoren. Zentrifugieren Sie, um die Zellen zu sedimentieren und zu inkubieren.

Nach der SeV-Fusion mit der Wirtszellmembran durchläuft das Virusgenom eine Transkription und anschließend eine Translation im Zytoplasma. Die ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren löst den Prozess der Zellreprogrammierung aus, ohne dass die Gene in das Wirtsgenom integriert werden.

Zentrifugieren Sie nun die Kultur, um die Viren zu entfernen. Die transduzierten Zellen werden in einem geeigneten Medium resuspendiert, gefolgt von der Beschichtung. Zentrifugieren Sie ferner, um Zelltrümmer zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in iNSC-Medien.

Anschließend säen Sie die Zellen in einer proteinbeschichteten Platte. Die Zellen heften sich an die Proteinhülle in der Platte. Ergänzen Sie die adhärenten Zellen an wechselnden Tagen mit iNSC-Medien. Ersetzen Sie nach einer Woche Kultur die verbrauchten Medien täglich durch frische iNSC-Medien.

Die Wachstumsfaktoren und chemischen Bestandteile in den Medien halten die Selbsterneuerung aufrecht und unterstützen die Pluripotenz einer Untergruppe transduzierter Zellen, indem sie vollständig zu iNSCs umprogrammiert werden. Im Laufe der Zeit beginnen die Zellen, iNSC-Kolonien zu bilden. Wählen Sie die gewünschten Völker für die Kultivierung aus.

Am Tag 0 werden die Zellen in MNC-Medium gesammelt und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Nach dem Zentrifugieren der Zellen bei 200 x g für 5 Minuten wird der Überstand aspiriert und die Zellen mit 1 Milliliter vorgewärmtem MNC-Medium resuspendiert. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und resuspendieren Sie sie dann mit vorgewärmtem MNC-Medium auf eine Konzentration von 200.000 Zellen pro Well in 24-Well-Platten.

Tauen Sie die Röhrchen, die aus einer Lagerung bei minus 80 Grad Celsius entnommen wurden, mit dem Sendai-Virus in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 5 bis 10 Sekunden auf und lassen Sie sie dann bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen sofort auf Eis legen. Geben Sie das aufgetaute Sendai-Virus in die Vertiefungen der 24-Well-Platte mit MNCs bei einer Infektionsvielfalt von 10. Um das Anbringen der Zellen zu erleichtern, zentrifugieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 1.000 x g und legen Sie die Platten anschließend bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator.

An Tag 1 werden die Zellen mit dem Medium in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Um die restlichen Zellen weiter zu lösen, spülen Sie die Wells mit 1 Milliliter MNC-Medium pro Well und geben Sie die Zellen mit Medium in das Röhrchen. Nachdem Sie diese Zellsuspension 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugiert haben, aspirieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern frischem, vorgewärmtem MNC-Medium und geben Sie sie in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.

Verwenden Sie an Tag 2 1 Milliliter pro Well mit zuvor verdünnten 50 Mikrogramm pro Mikroliter Poly-D-Lysin und D-PBS, um 6-Well-Platten mindestens 2 Stunden lang bei Raumtemperatur zu beschichten. Poly-D-Lysin aus den 6-Well-Platten aspirieren und auf der vertikalen Reinbank ca. 10 Minuten trocknen lassen. Geben Sie dann 1 Milliliter pro Vertiefung eines zuvor verdünnten Laminins von 5 Mikrogramm pro Milliliter in die 6-Well-Platten und inkubieren Sie es 4 bis 6 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um es zu beschichten. Waschen Sie die Platten vor Gebrauch mit D-PBS.

An Tag 3 transduzierten alle Sendai-Virus-transduzierten MNCs in induziertem neuralem Stammzellmedium auf den mit Poly-D-Lysin-Laminin beschichteten 6-Well-Platten. Geben Sie an den Tagen 5 und 7 vorsichtig 1 Milliliter 37 Grad Celsius vorgewärmtes iNSC-Medium in jede Vertiefung der 6-Well-Platten.

Ersetzen Sie von Tag 9 bis Tag 28 das Medium täglich durch frisches, vorgewärmtes iNSC Medium. Überwachen Sie das Auftreten von iNSC-Kolonien und wählen Sie in etwa 2 bis 3 Wochen mit Hilfe von Pipetten aus gebranntem Glas Kolonien mit geeigneter Morphologie aus. Übertragen Sie dann jede Kolonie zur Expansion in eine separate Vertiefung einer 6-Well-Platte.