Automatisierte Kapillarelektrophorese-basierte Analyse der Fragmentgrößenverteilung von cfDNA: eine DNA-Mikrochip-basierte Methode zur Untersuchung der Größenverteilung von DNA-Fragmenten, die aus Bioflüssigkeiten isoliert wurden
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 4:48 Min. • July 8th, 2025
Eine sterbende Zelle setzt Fragmente von zellfreier oder cfDNA außerhalb der Zelle frei. Um die Größenverteilung von cfDNA-Fragmenten zu analysieren, beginnen Sie mit einem Multiwell-DNA-Chip - einem elektrophoretischen Miniatur-Kapillarsystem. Jedes Well im Chip enthält an seiner Basis zahlreiche mikrofluidische Trennkanäle.
Laden Sie die Polysaccharid-Gel-Matrix und die Fluoreszenzfarbstoffmischung in die dafür vorgesehene Vertiefung auf dem Chip. Positionieren Sie den Chip auf der Ansaugeinheit, die mit einer leeren Spritze ausgestattet ist. Schließen Sie die Ansaugeinheit und drücken Sie den Kolben nach unten, um Druck nach unten zu erzeugen. Dies erleichtert den Eintrag des viskosen Gels aus der Vertiefung in den jeweiligen Trennkanal.
Öffnen Sie die Assemblierung, und füllen Sie die verbleibenden Vertiefungen mit cfDNA-Suspension und einer DNA-Leiter des bekannten Größenbereichs. Montieren Sie den Chip auf dem Fragmentanalysator. Die starke Spannung steuert den Eintritt der cfDNA-Suspension aus den Probenvertiefungen in den mit der Gelmatrix vorgeladenen Trennkanal, wo die DNA mit dem Farbstoff gefärbt wird.
Wenn sich die DNA von der Kathode zur Anode bewegt, wandern kleinere DNA-Fragmente schneller durch das Gel, während sich die größeren Fragmente langsamer bewegen. Dies führt zu einer größenbasierten Trennung von DNA-Fragmenten. Der Detektor erkennt die relative Fluoreszenz der Fragmente, vergleicht sie mit der DNA-Leiter und erstellt ein Elektropherogramm - ein Diagramm, das die Größenverteilung der cfDNA anzeigt.
Um die Größe der DNA-Fragmente zu analysieren, befestigen Sie zunächst die Grundplatte an der Chip-Priming-Station und stellen Sie den Clip auf die niedrigste Position ein. Setzen Sie einen neuen hochempfindlichen DNA-Chip auf die Chip-Priming-Station und geben Sie 9 Mikroliter Gel-Farbstoff-Mischung auf den Boden der G-Chip-Vertiefung. Positionieren Sie den Kolben auf 1 Milliliter und schließen Sie die Chip-Ansaugstation. Schließen Sie die Verriegelung der Verriegelung, bis sie einrastet, stellen Sie den Timer auf 60 Sekunden und drücken Sie den Stößel nach unten, bis er vom Clip gehalten wird.
Verwenden Sie nach genau 60 Sekunden den Clip-Entriegelungsmechanismus, um den Stößel zu lösen. Wenn sich der Kolben mindestens bis zur 300-Mikroliter-Marke zurückgezogen hat, warten Sie 5 Sekunden, bevor Sie den Kolben langsam in die 1-Milliliter-Position zurückziehen. Öffnen Sie die Chip-Priming-Station, um 9 Mikroliter der Gel-Farbstoff-Mischung zu entfernen, und übertragen Sie das Gel auf den Boden der Vertiefung "G" des hochempfindlichen DNA-Chips.
Um den DNA-Marker zu laden, geben Sie 5 Mikroliter DNA-Marker in die Leitervertiefung und in die 11 Probenvertiefungen. Um die Leiter und die Proben zu laden, geben Sie 1 Mikroliter der DNA-Leiter in die Vertiefung der DNA-Leiter, 1 Mikroliter Probe in die verwendeten Probenvertiefungen und 1 Mikroliter Marker in die unbenutzten Probenvertiefungen. Platzieren Sie den hochempfindlichen DNA-Chip horizontal in den Adapter für 60 Sekunden mit 2.400 Umdrehungen pro Minute und achten Sie darauf, dass die Ausbuchtung, die den hochempfindlichen DNA-Chip fixiert, nicht beschädigt wird.
Vergewissern Sie sich nach dem Vortexen, dass die Elektrodenpatrone richtig eingesetzt ist und dass der Chip-Selektor auf doppelsträngige hochempfindliche DNA ausgerichtet ist. Montieren Sie den hochempfindlichen DNA-Chip vorsichtig in die Buchse und vergewissern Sie sich, dass die Elektrodenpatrone genau in die Vertiefungen des Chips eingesetzt ist, bevor Sie den Deckel schließen. Auf dem Bildschirm der Fragmentanalyse-Software wird ein Chip-Symbol angezeigt, das anzeigt, dass der Chip eingesetzt und der Deckel geschlossen wurde.
Um die Analyse zu starten, öffnen Sie das Assay-Menü und wählen Sie den doppelsträngigen DNA-Assay mit hoher Sensitivität aus. Geben Sie die Beispielnamen in die Tabelle ein und klicken Sie auf "Start", um den Chiplauf zu starten. Entfernen und entsorgen Sie den Chip am Ende des Laufs sofort gemäß der guten Laborpraxis.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Analyse der Größenverteilung von von absterbenden Zellen freigesetzten cfDNA-Fragmenten (cell-free DNA) mithilfe eines Multicell-DNA-Chips beschrieben. Das Verfahren umfasst das Beladen des Chips mit einer Gelmatrix und den cfDNA-Proben, gefolgt von einer elektrophoretischen Trennung entsprechend der Fragmentgröße.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Molekularbiologie
- Genomik
Hintergrund
- Freie zelluläre DNA (cfDNA) wird von absterbenden Zellen freigesetzt und kann Aufschluss über zelluläre Prozesse geben.
- Die Analyse der cfDNA-Größenverteilung kann helfen, verschiedene biologische Zustände zu verstehen.
- Elektrophorese ist eine gängige Methode zur Analyse von DNA-Fragmenten.
- Mehrfach-Genchips ermöglichen die Hochdurchsatzanalyse von Proben.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Analyse der Größenverteilung von cfDNA-Fragmenten.
- Nutzung eines Multikammer-DNA-Chips für die effiziente Trennung und Detektion von DNA-Fragmenten.
- Bereitstellung eines Protokolls, das in Laborumgebungen leicht befolgt werden kann.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines Multicell-DNA-Chips mit einer Gelmatrix und Fluoreszenzfarbstoff.
- Einfüllen von cfDNA-Proben und einer DNA-Leiter in vorgesehene Vertiefungen.
- Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten entsprechend ihrer Größe.
- Analyse der Fragmentgrößen mittels eines Fragmentanalysegeräts und Software.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Trennung von cfDNA-Fragmenten basierend auf ihrer Größe wurde erreicht.
- Das erzeugte Elektropherogramm zeigte deutliche Muster der Größenverteilung.
- Die Methode zeigte eine hohe Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit.
- Die Ergebnisse können für weitere biologische und klinische Studien verwendet werden.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ist wirksam zur Analyse der Fragmentgrößen von cfDNA.
- Mehrfach-PCR-DNA-Chips können die Durchsatzleistung bei der cfDNA-Analyse verbessern.
- Diese Technik kann in verschiedenen Forschungs- und klinischen Anwendungsbereichen eingesetzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die automatisierte Kapillarelektrophorese ermöglicht eine präzise Größenbestimmung von cfDNA-Fragmenten und unterstützt die Target-Validierung bei der Entdeckung onkologischer Biomarker. Diese Methode liefert quantitative Daten zur Größenverteilung, die zur mechanistischen Entlastung von Liquid-Biopsy-Assays beitragen. Sie erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem sie Fragmentprofile mit biologischen Mechanismen des Zelltods verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung apoptotischer Signalwege durch die Größenprofilierung von cfDNA.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem Fragmentmuster mit zellulären Prozessen korreliert werden.
- Prädiktiver Wert: Verbessert die Portfolio-Priorisierung, indem mechanistische Einblicke in die durch Medikamente induzierte Zelltod bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet standardisierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Screening-Analyse von cfDNA-Biomarkern vor.
- Operationaler Wert: Gewährleistet die Reproduzierbarkeit des Assays durch eine größenbasierte Trennung und die Quantifizierung mittels Elektropherogramm.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform in mehreren Probendurchsätzen mit konsistenter Größengenauigkeit.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Entdeckungsphase der cfDNA-Analyse mit der präklinischen Validierung über Referenzwerte für Größenverteilungen.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Fortschrittskriterien durch Definition von Fragmentgrößenschwellen, die mit biologischer Aktivität verknüpft sind.
- Mechanistische Risikominderung: Konzentriert sich auf den prädiktiven Wert der cfDNA-Größenbestimmung bei der Überwachung therapeutischer Wirkmechanismen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein, indem sie Größenangaben liefert, die Aufschluss über die Relevanz von Biomarkern geben.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Zelltodmechanismen durch Fragmentgrößenanalyse.
- Screening: Ermöglicht die Einsatzbereitschaft des Assays mit reproduzierbaren Elektropherogrammausgaben zur cfDNA-Quantifizierung.
- Analytik: Liefert quantitative Größenmessungen, die Vergleiche über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Kontinuität durch standardisierte Größenprofile, die in Krankheitsmodellen anwendbar sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert den mikrofluidischen Chip als wiederverwendbare Plattform für die cfDNA-Analyse über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die mechanistische Uneindeutigkeit bezüglich der Herkunft von cfDNA verringert wird.
- Operationaler Wert: Bietet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit in Workflows zur Fragmentgrößenbestimmung.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem eine datengestützte Beurteilung biologischer Aktivität ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung durch objektive Metriken zur cfDNA-Größenverteilung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit mikrofluidischen Chips und den Prinzipien der elektrophoretischen Trennung.
- Abhängig von der Instrumentierung des Fragmentanalyzers und kompatiblen DNA-Chips mit hoher Empfindlichkeit.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Probenaufgabe und der Zubereitung von Gel-Färbeprotokollen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Wechsel zu verschiedenen Typen biologischer Flüssigkeitsproben.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Verbrauchbarkeit der Chips und die Beschränkung auf einmalige Nutzung pro Durchlauf.
Biopharma FAQs
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026