MSC Seeed Scaffold Preparation: Eine Technik zur Vorbereitung von Gerüsten, die mit mesenchymalen Stammzellen besiedelt sind, für die chirurgische Implantation in das Mausmodell

Krebszellen produzieren chemotaktische Homing-Faktoren, um die mesenchymalen Stammzellen oder MSCs aus den Blutgefäßen in Richtung des Tumorortes zu locken.

Um die Wirkung dieser Zellen auf das Tumorwachstum in vitro zu untersuchen, nehmen Sie zunächst ein sterilisiertes Gerüstsubstrat. Übertragen Sie es auf eine Well-Platte mit dem gewünschten Medium, um das Gerüst vorzubefeuchten. Legen Sie es auf eine trockene Oberfläche, um überschüssige Medien zu entfernen, die am Gerüst haften bleiben, um die Zellhaftung zu verbessern. Bringen Sie das teilweise getrocknete Gerüst in eine frische Mulde. Säen Sie einen Tropfen MSC-Suspension auf das Gerüst.

Fügen Sie zusätzlich mehr Medien in die Ecken der Vertiefung ein, um eine Hydratationskammer zu schaffen, die die Verdunstung des Mediums aus dem Tropfen während der nachfolgenden Inkubation verhindert. Inkubieren, damit die MSCs an der Oberfläche des Gerüsts haften können. Drehen Sie das Gerüst um, um die nicht gesähte Oberfläche freizulegen. Pipettieren Sie einen frischen Tropfen MSC-Suspension auf dieser Seite und lassen Sie die MSCs haften.

Nachdem die MSCs an beiden Seiten des Gerüsts haften, bedecken Sie es mit weiteren Medien, um sicherzustellen, dass alle Zellen mit dem Medium in Kontakt kommen. Inkubieren, bis die MSCs wachsen und in die Zwischenräume und Poren des Gerüsts eindringen. Das MSC-Saatgerüst ist bereit für die chirurgische Implantation.

Bereiten Sie die Gerüste 48 Stunden vor der Implantation bei Mäusen vor, indem Sie die PLA-Gerüste zunächst in resektionshohlraumgroße Stücke von etwa 2 x 2 Millimetern schneiden. Sterilisieren Sie die Gerüste, indem Sie sie 15 Minuten lang in 70%iges Ethanol tauchen. Tauchen Sie die Gerüste nach 15 Minuten in PBS. Platzieren Sie dann die Gerüste in Dulbecco's Modified Eagle's Medium, das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, während Sie die Zellen für die Aussaat vorbereiten.

Um die Zellen vorzubereiten, heben Sie zunächst kultivierte MSCs mit 0,05 % Trypsin an. 5 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Stellen Sie nach der Inkubation sicher, dass sich die Zellen angehoben haben. Geben Sie dann DMEM in den Kolben, um das Trypsin zu inaktivieren. Übertragen Sie anschließend den Kolbeninhalt in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Pelletieren Sie dann 5 mal 10 zu den fünften MSCs für jedes Gerüst durch Zentrifugation bei 100 x g für 5 Minuten.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand aspiriert und die MSCs in 5 Mikrolitern DMEM pro 5 mal 10 in die fünften Zellen resuspendiert. Entfernen Sie dann ein Gerüst aus der DMEM-Immersion mit einer Pinzette und legen Sie es auf den Deckel der 6-Well-Platte. Heben Sie das Gerüst vom Deckel ab und hinterlassen Sie ein Tröpfchen überschüssiges DMEM. Setzen Sie das Gerüst wieder auf den Deckel und stellen Sie es an einen neuen trockenen Ort. Wiederholen Sie dies drei- bis fünfmal. Legen Sie dann das teilweise getrocknete Gerüst für die Aussaat in eine neue 6-Well-Platte.

Ein teilgetrocknetes Gerüst sorgt für optimale Ergebnisse bei der Zellaussaat. Wenn das Gerüst zu nass ist, rutschen die Zellen vom Gerüst und haften an der darunter liegenden Platte. Wenn das Gerüst zu trocken ist, breitet sich das Tröpfchen nicht über das gesamte Gerüst aus, was zu einer schlechten anfänglichen Zellverteilung führt.

Mischen Sie das Röhrchen mit den MSCs vorsichtig mit einer Pipette, um die Suspension zu homogenisieren, da sich einige Zellen möglicherweise am Boden abgesetzt haben. Pipettieren Sie langsam 2,5 Mikroliter frisch gemischte MSC-Suspension direkt auf das Gerüst, so dass ein kleiner Tropfen über dem Gerüst entsteht. Geben Sie 300 Mikroliter DMEM an die Ränder jeder Vertiefung, um eine schnelle Verdunstung des Zelltröpfchens zu verhindern. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Zellen an das Gerüst anheften können.

Drehen Sie die Gerüste nach der Inkubation mit einer Pinzette vorsichtig in der Vertiefungsplatte um. 2,5 Mikroliter frisch gemischte MSC-Suspension aussäen, um insgesamt 5 mal 10 auf die fünften Zellen pro Gerüst zu geben. Nach einer Inkubation von 30 Minuten, damit sich die Zellen an das Gerüst anheften können, bedecken Sie die Gerüste mit DMEM, indem Sie 2 Milliliter in jede Vertiefung der 6-Well-Platte geben. Heben Sie die Gerüste vorsichtig an, damit das Medium darunter fließen kann. Inkubieren Sie in diesem Zustand 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius vor der Implantation.