Fluoreszenzgesteuerte Tumorresektion und MSC-gesäte Gerüstimplantation im Mausmodell: Ein chirurgisches Verfahren zur Verabreichung therapeutischer mesenchymaler Stammzellen in die Resektionshöhle von Hirntumoren im Mausmodell

Mesenchymale Stammzellen oder MSCs können gentechnisch so verändert werden, dass sie den Tumornekrosefaktor-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden oder TRAIL exprimieren, der an spezifische Rezeptoren auf Tumorzellen bindet und Apoptose induziert.

Um diese MSCs in ein tumortragendes Mausmodell zu bringen, wird zunächst ein TRAIL-exprimierendes MSC-gesätes Biopolymer-Gerüst hergestellt. Als nächstes befestigen Sie eine anästhesierte Maus mit fluoreszenzmarkiertem Hirntumor auf einem stereotaktischen Rahmen. Die Maus verfügt über ein vorher festgelegtes Schädelfenster für den Zugang zum Gehirn.

Halten Sie die Körpertemperatur der Maus mit einem Heizkissen aufrecht. Sterilisieren Sie die Operationsstelle und machen Sie einen Mittelschnitt auf der Kopfhaut. Entfernen Sie das subdermale Fett, um das Schädelfenster freizulegen. Ziehen Sie die Dura mater vom Fenster ab und legen Sie das darunter liegende Parenchymgewebe und den Tumor frei.

Visualisieren Sie nun unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop den fluoreszierenden Tumor. Aspirieren Sie das fluoreszierende Tumorgewebe aus dem Gehirn. Mit Kochsalzlösung waschen, um den physiologischen pH-Wert wiederherzustellen. Implantieren Sie das MSC-gesäte Gerüst in die Resektionskavität. Tragen Sie ein geeignetes Blutstillungsmittel auf, um das Gerüst an Ort und Stelle zu halten. Schließen Sie den Schnitt und lassen Sie die Maus sich erholen.

Nach der Implantation sezernieren Tumorzellen innerhalb der verbleibenden Tumorherde lösliche Faktoren, die die Wanderung von MSCs aus dem Gerüst zu den Tumorzellen erleichtern. Die von MSCs sezernierten TRAIL-Proteine binden an spezifische Rezeptoren auf Tumorzellen und induzieren so den apoptotischen Zelltod.

Beginnen Sie damit, den stereotaktischen Rahmen auf dem Tisch eines Fluoreszenz-Präparier-Stereomikroskops zu platzieren. Befestigen Sie dann die anästhesierte Maus auf dem stereotaktischen Rahmen mit kontinuierlicher inhalativer Anästhesiezufuhr über einen Isofluran-Nasenkonusadapter. Halten Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen aufrecht. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Sterilisieren Sie dann die Inzisionsstelle der Kopfhaut mit einer Reihe von drei Alkohol- und drei Betadin-Tüchern.

Führen Sie den Zehenquetschreflextest an jeder Gliedmaße durch und bestätigen Sie die negative Reaktion, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten. Mit einer Pinzette die Kopfhaut zusammendrücken und sanft anheben. Nachdem Sie einen linearen rostral-kaudalen Schnitt in der Mittellinie mit einer chirurgischen Schere gemacht haben, bewässern Sie die Inzisionsstelle mit PBS und entfernen Sie das subdermale Fett mit einem Wattestäbchenapplikator in kreisenden Bürstenbewegungen.

Ordnen Sie die Haut so an, dass das zuvor etablierte Schädelfenster vollständig sichtbar ist. Verwende eine 18-Gauge-Nadel, um die Dura vorsichtig von innen bis zu den Rändern des Schädelfensters zu durchstechen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis der Schnitt das Innere des Fensters vollständig nachzeichnet. Entfernen Sie die Dura, indem Sie sie mit einer feinen Pinzette abziehen, wodurch das darunterliegende Parenchym und der Tumor zum Vorschein kommen.

Dimmen Sie als Nächstes die Raumbeleuchtung und schalten Sie den Stereomikroskop-Fluoreszenzmodus ein. Lokalisieren Sie den U87 mCherry und Firefly Luciferase exprimierenden Tumor. Legen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze in das Ende des Schlauchs einer Vakuumpumpe. Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein. Sezieren Sie den Tumor, indem Sie das fluoreszierende Gewebe vorsichtig aspirieren, bis kein Signal mehr vorhanden ist. Um die Blutung zu kontrollieren, spülen Sie mit kaltem PBS und üben Sie mit einem Wattestäbchenapplikator gleichmäßigen Druck aus.

Verwenden Sie eine Kombination aus Kochsalzlösung, gleichmäßigem Druck mit einem Wattestäbchen-Applikator und/oder einem Blutstillungsmittel wie SURGICEL, um die Blutung vor dem Implantieren des Gerüsts zu stoppen. Wenn es nicht richtig kontrolliert wird, kann sich ein potenziell gefährliches Hämatom bilden. Schalten Sie nach der Resektion die Vakuumpumpe aus und entsorgen Sie die Pipettenspitze. Schalten Sie die Fluoreszenz aus und die Raumbeleuchtung geht wieder an. Tauchen Sie unmittelbar vor der Implantation ein mit MSC gesätes PLA-Gerüst langsam in PBS, um unerwünschte Medien und zugehörige Komponenten zu entfernen. Implantieren Sie das Gerüst in die Resektionshöhle.

Fügen Sie bei Bedarf 1 Mikroliter Fibrinogen hinzu, gefolgt von 1 Mikroliter Thrombin, um das Gerüst an Ort und Stelle zu befestigen. Nachdem Sie die Dura entfernt und den Knochenlappen aus dem Schädelfenster bereits verworfen haben, versiegeln Sie die Wunde, indem Sie die Haut schließen und chirurgischen Kleber auftragen. Nehmen Sie das Tier aus der Inhalationsnarkose und lassen Sie es auf einer erhitzten Oberfläche genesen.