Fluoreszenzmarkierung von Gliomzellen: Eine lentivirale vektorbasierte Transfektionsmethode zur Gewinnung von Gliomzellen, die fluoreszierendes Protein für die Tiefenbildgebung exprimieren
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 3:39 Min. • July 8th, 2025
Bei der In-vivo-Bildgebung von Hirntumoren werden fluoreszenzmarkierte Krebszellen in das Gehirn von Mäusen injiziert, um die Tumorentwicklung zu beobachten. Für die Fluoreszenzmarkierung inkubieren Sie Gliomzellen mit Lentivirus-Partikeln. Der lentivirale Vektor trägt das Gen für das infrarotfluoreszierende Protein iRFP.
Das Virus bindet an die Zelloberfläche des Glioms und gibt RNA in die Zelle ab. Zelluläre Enzyme wandeln die virale RNA in doppelsträngige DNA um, die sich in das zelluläre Genom integriert und die iRFP-Expression ermöglicht. Die Anregungs- und Emissionsmaxima von iRFP liegen in einem nahinfraroten Bereich, in dem das Gewebe eine minimale Absorption und Streuung aufweist. Dies ermöglicht eine genaue Bildgebung des tiefen Gewebes.
Entfernen Sie anschließend das verbrauchte Medium und fügen Sie Trypsin hinzu. Trypsin, ein Protease-Enzym, verdaut die Adhäsionsproteine und löst die Zellen von der Kolbenoberfläche. Pipettieren Sie wiederholt, um die einzelnen Zellen zu trennen. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem Röhrchen und zentrifugieren Sie. Fügen Sie nun einen geeigneten Puffer hinzu, um das Pellet wieder zu suspendieren.
Geben Sie die Zellsuspension in Durchflusszytometrie-Röhrchen und färben Sie die Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff, DAPI. DAPI färbt den Zellkern abgestorbener Zellen hellblau und unterscheidet sie so von lebenden Zellen. Sortieren Sie mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer oder FACS die lebenden iRFP-positiven Zellen aus anderen Zellpopulationen anhand ihrer Fluoreszenz. Die isolierten Zellen können für die Injektion in Mäuse zur Tumorbildgebung verwendet werden.
Beginnen Sie damit, 1 mal 10 bis die sechste Glioblastomzelle in 5 Millilitern Medium in eine 10-Zentimeter-Schale zu säen, um eine 24-stündige Inkubation in einem Zellkultur-Inkubator durchzuführen. Am nächsten Morgen transduzieren Sie die Zellen mit Lentiviren, die ein geeignetes fluoreszierendes Protein von Interesse bei einer Infektionsvielfalt von 5 exprimieren, und bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück.
Nach 24 Stunden wird der Überstand durch 5 Milliliter frisches Medium ersetzt und die Kultur weitere 48 Stunden inkubiert. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das Medium durch 3 bis 5 Milliliter Trypsin für 10 bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius, gefolgt von vorsichtigem Pipettieren, um die abgelösten Zellen vollständig zu dissoziieren.
Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Sortierlösung. Teilen Sie die Zellen in die entsprechende Anzahl von FACS-Röhrchen auf und codieren Sie die Zellen mit DAPI für den Ausschluss toter Zellen. Laden Sie dann die Röhrchen auf das Durchflusszytometer und sortieren Sie die lebenden Zellen entsprechend ihrer Fluoreszenzkonstruktexpression in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit frischer Sortierlösung.
Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie die konstruktpositiven/DAPI-negativen Zellen in 5 Millilitern Kulturmedium und säen sie für ihre Kultur bei 37 Grad Celsius für 48 bis 72 Stunden in eine neue 10-Zentimeter-Schale. Teilen Sie am Ende der Inkubation die Zellen für die Aussaat in mehrere Schalen auf, um nachfolgende In-vivo-Experimente durchzuführen.
Übersicht
In diesem Artikel werden In-vivo-Verfahren zur Bildgebung von Hirntumoren unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Gliomzellen in Mausmodellen beschrieben. Die Methodik beinhaltet den Einsatz von Lentiviren-Vektoren zur Expression von Infrarot-Fluoreszenzproteinen, wodurch die Bildgebung der Tumorentwicklung in tiefen Gewebeschichten ermöglicht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Bildgebende Verfahren
Hintergrund
- Die In-vivo-Bildgebung ist entscheidend für die Untersuchung des Tumorprogresses.
- Fluoreszierende Proteine ermöglichen die Visualisierung von Krebszellen.
- Lentivirale Vektoren eignen sich effektiv für die Genübertragung in Gliomzellen.
- Die Nahinfrarot-Bildgebung minimiert Gewebeinterferenzen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Verfolgung des Verhaltens von Gliomzellen in vivo.
- Verbesserung der Genauigkeit der Tumorbildgebung unter Verwendung fluoreszenter Marker.
- Isolierung lebender Gliomzellen für weitere Experimente.
Verwendete Methoden
- Transduktion von Gliomzellen mit Lentivirus, das iRFP exprimiert.
- Durchflusszytometrie zur Sortierung lebender Zellen basierend auf Fluoreszenz.
- Zellkultivierungstechniken zur Aufrechterhaltung von Gliomzellen.
- Verwendung von DAPI zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Expression von iRFP in Gliomzellen.
- Effektive Isolierung lebender Zellen mittels FACS.
- Nachweis der Fähigkeit zur Bildgebung in tieferliegendem Gewebe.
- Einrichtung eines Protokolls für die in vivo Tumorbildgebung.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Tumordynamiken.
- Die fluoreszenzmarkierte Färbung verbessert die Untersuchung des Gliomfortschritts.
- Dieser Ansatz kann auf andere Krebstypen für ähnliche Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die fluoreszenzmarkierte Kennzeichnung von Gliomzellen mittels lentiviraler Vektoren ermöglicht die Bildgebung in tiefen Gewebeschichten zur Verfolgung der Tumorentwicklung in vivo. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er einen stabilen und quantifizierbaren Endpunkt für das Verhalten von Gliomzellen in präklinischen Modellen bereitstellt. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der Onkologie-Forschung, da sie eine longitudinale Überwachung therapeutischer Interventionen in physiologisch relevanten Systemen erlaubt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Gliom-Tumorigenität durch stabile Expression fluoreszierender Reporter.
- Operativer Wert: Bietet ein konsistentes zelluläres System für longitudinale in-vivo-Bildgebungsstudien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Fluoreszenzsignale, die mit Plattformen für hochinhaltsbasierte Bildgebung kompatibel sind.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays mittels FACS-isolierter, homogener Zellpopulationen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die mechanistische Ent-Risikobewertung durch Echtzeit-Visualisierung des Tumorwachstums und der Therapieantwort.
- Operativer Wert: Stellt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung mithilfe nachverfolgbarer Zelllinien sicher.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung, indem sie bildgebungstaugliche Gliomzellen bereitstellt.
- Entdeckungsforschung: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch langzeitliche Verfolgung markierter Gliomzellen im lebenden Organismus.
- Screening: Ermöglicht die reproduzierbare Bewertung von Substanzen unter Verwendung standardisierter, fluoreszenzmarkierter Zelllinien.
- Analytik: Liefert quantitative Fluoreszenzsignale zur Beurteilung des Tumoranteils und des therapeutischen Ansprechens.
- Translationale Forschung: Verbindet die In-vitro-Engineering mit In-vivo-Bildgebung durch stabile genomische Integration von iRFP.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Erzeugung bildgebungstauglicher Krebszelllinien in verschiedenen Onkologieprogrammen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen in Gliommodellen durch direkte Visualisierung der Tumordynamik.
- Operationaler Wert: Steigert die Reproduzierbarkeit durch FACS-Reinigung lebender, iRFP-positiver Zellen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem frühe Wirksamkeitsaussagen in präklinischen Modellen ermöglicht werden.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung durch objektive, bildgebungsbasierte Metriken zur Tumorbürde.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der lentiviralen Transduktion und der Durchflusszytometrie.
- Setzt Zugang zu FACS-Geräten und Nahinfrarot-Bildgebungssystemen voraus.
- Erfordert die Standardisierung der MOI und der Selektionsbedingungen über verschiedene Zelllinien hinweg.
- Beinhaltet Sicherheitsaspekte im Umgang mit lentiviralen Vektoren.
- Ist durch die Transfektionseffizienz und eine mögliche zeitabhängige Stilllegung fluoreszierender Konstrukte begrenzt.
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Zuletzt aktualisiert: 22 August 2026