JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Krebsforschung
0 Aufrufe • 4:32 Min. • July 8th, 2025
Hirntumor-Stammzellen oder BTSCs - eine Untergruppe von Zellen innerhalb von Hirntumoren - besitzen Selbsterneuerungsfähigkeiten und tragen zur Tumorprogression und Therapieresistenz bei. Um die Wirkung von Arzneimitteln auf die BTSC-Invasion in vitro zu bestimmen, beginnen Sie mit BTSC-Suspensionen in einem geeigneten Medium in Kulturflaschen. Behandeln Sie eine der Suspensionen mit dem gewünschten Medikament.
Inkubieren Sie die Kolben. Die Medienkomponenten fördern die Zellproliferation. Die Zellen bleiben in der Schwebe und bilden dadurch kugelförmige Cluster, die Neurosphären genannt werden. Wenn Sie die gewünschte Größe erreicht haben, sammeln Sie die Neurosphären. Lassen Sie sie durch die Schwerkraft sedimentieren und entfernen Sie das Medium. Dann resuspendieren Sie die unbehandelten und medikamentös behandelten Neurosphären in gekühlten Medien, die ein geeignetes extrazelluläres Matrixprotein und das Medikament enthalten.
Plattieren Sie die Suspensionen in einer gekühlten Multiwell-Platte. Lassen Sie die Neurosphären zum Bohrlochboden sedimentieren, um eine bessere Bildgebung zu ermöglichen. Als nächstes inkubieren Sie für die Matrixproteinpolymerisation und betten die darin enthaltenen Neurosphären ein. Bilden Sie die Neurosphären über einen längeren Zeitraum mit der Lebendzellmikroskopie ab. In Kultur sezernieren eingebettete BTSCs proteolytische Enzyme, die die Matrixproteine abbauen und so die Zellmigration ermöglichen.
Im Laufe der Zeit schafft ein erhöhter Matrixabbau eine geeignete Mikroumgebung für die Invasion von BTSC aus Neurosphären in die umgebende Matrix. Messen Sie mit einer geeigneten Software die Gesamtoberfläche der Neurosphären zu verschiedenen Zeitpunkten. Die unbehandelten BTSCs weisen eine vergrößerte Oberfläche auf, was auf eine erhöhte Invasionsrate hinweist als die medikamentös behandelten BTSCs.
Um die BTSC-Neurosphäreninvasion zu beurteilen, geben Sie zunächst die interessierende Verbindung in der gewünschten Konzentration für den vorgegebenen Zeitverlauf vor der Neurosphäreninvasion in den Kolben. Wenn die durchschnittliche Neurosphärengröße etwa 150 bis 200 Mikrometer erreicht, kippen und mischen Sie den Kolben vorsichtig mit einer Pipette und geben Sie 500 Mikroliter der resuspendierten BTSC-Neurosphären in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Versuchsbedingung auf Eis.
Aspirieren Sie so viel wie möglich des Mediums vom Boden jedes 1,5-Milliliter-Röhrchens, ohne das Neurosphären-Pellet zu verlieren, und resuspendieren Sie die Neurosphären vorsichtig in 500 Mikrolitern frisch zubereiteter 0,4-Milligramm-Kollagenlösung pro Milliliter Typ I. Übertragen Sie 100 Mikroliter der in Kollagen suspendierten Neurosphären in drei Vertiefungen pro Bedingung auf eine neue 96-Well-Platte auf Eis und lassen Sie die Neurosphären 5 Minuten lang ruhen.
Es ist wichtig, dass sich die Neurosphären 5 Minuten lang auf dem Eis absetzen können. Andernfalls befinden sich die Kugeln für die Bildgebung nicht auf derselben Fokusebene. Nach 5 Minuten Kollagenpolymerisation im Zellkultur-Inkubator übertragen Sie die Platte in das Tablett des Lebendzell-Bildgebungssystems, um ein Referenzbild der Neurosphärengröße zum Zeitpunkt der Plattierung zu erhalten, bevor die Invasion beginnt. Stellen Sie dann die Software so ein, dass sie alle 1 bis 2 Stunden Bilder aufnimmt, bis die Invasionsrate ein Plateau erreicht hat, in der Regel um 24 Stunden.
Um die zunehmende Oberfläche der BTSCs abzubilden, wenn sie im Laufe der Zeit in die Matrix eindringen, verwenden Sie das 10x-Objektiv, um vier Bilder pro Well für jeden Satz von drei Replikatwells aufzunehmen. Um die relative Zelloberfläche zu bestimmen, die als prozentualer Zusammenfluss der Vertiefung dargestellt wird, richten Sie eine Verarbeitungsdefinition ein, die die Zellen vor dem Hintergrund der Vertiefung speziell hervorhebt. Erfassen Sie dann die Daten als Gesamtzelloberfläche für jede Vertiefung zu jedem Zeitpunkt. Bestimmen Sie den Mittelwert der drei Replikationsvertiefungen und stellen Sie die Invasion der BTSCs grafisch dar, indem Sie die zunehmende Zellfläche im Laufe der Zeit darstellen.