Isolierung und Kultivierung von primären Hirnperizyten: Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Perizyten aus Rinderhirnkapillaren ohne Kontamination mit Endothelzellen

Im Zentralnervensystem sind Perizyten multifunktionale Zellen, die die Endothelzellen umhüllen, die die innere Zellauskleidung der Kapillaren bilden. Perizyten helfen, den Blutfluss zu regulieren und die Homöostase des Gehirns aufrechtzuerhalten.

Um Perizyten zu isolieren, beginnen Sie mit der Entnahme von gefrorenen Rinderhirnkapillaren in einer Durchstechflasche. Füllen Sie den Inhalt nach dem Auftauen in ein Röhrchen mit dem gewünschten Medium. Zentrifugieren Sie, um die Kapillaren zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand des Gefriermediums. Das Kapillarpellet wird in Medien resuspendiert und die Suspension in einen mit extrazellulären Matrixproteinen beschichteten Kolben ausgesät.

Inkubieren, damit die Kapillaren an der Beschichtung im Kolben haften können. Ersetzen Sie das Medium durch heparinhaltige Medien. In Kultur fördert die Proteinbeschichtung der extrazellulären Matrix die Migration der Perizyten von den Kapillarfragmenten und die Proliferation, während Heparin die Migration der Endothelzellen stimuliert.

Ersetzen Sie die verbrauchten Medien durch heparinhaltige Medien. Im Laufe der Zeit projizieren Perizyten längliche Fortsätze, die stark am Kolben haften. Mit begrenztem Substratraum vermehren sich Endothelzellen und bilden eine kontaktgehemmte Monoschicht. Bei Erreichen der entsprechenden Perizytendichte wird das Medium entfernt und der Kolben mit Puffer gewaschen.

Verwenden Sie Trypsin-EDTA, um die lose gebundenen Endothelzellen aus dem Kolben zu lösen. Fügen Sie anschließend Medien hinzu, um die Trypsin-EDTA-Aktivität zu neutralisieren. Wiederholtes Waschen mit Medien, um die abgelösten Endothelzellen zu entfernen. Fügen Sie Medien hinzu und stellen Sie sicher, dass die Perizyten am Kolben haften. Inkubieren Sie die mit Perizyten angereicherte Kultur, um sich zu vermehren.

Beginnen Sie damit, ein Fläschchen mit Kapillaren in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad aufzutauen. Sobald die Kapillaren aufgetaut sind, geben Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen mit 30 Millilitern DMEM-comp und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 500 x g. Entfernen Sie dann das Medium aus dem Röhrchen und suspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern frischem DMEM-comp. Übertragen Sie die Suspension in einen beschichteten T75-Kolben und lassen Sie die Kapillaren 4 bis 6 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 10 % Kohlendioxid am Boden haften. Nach der Inkubation wird der Kolben unter einem Lichtmikroskop untersucht.

Fraktionen von Kapillaren sollten nun am Boden des Kolbens befestigt werden. Am 4. Tag, nachdem Sie die Kapillaren ausgesät haben, untersuchen Sie sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie zu etwa 60 % bis 70 % konfluent sind. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS. Fügen Sie 2 Milliliter aufgetautes Trypsin-EDTA hinzu und lassen Sie den Kolben 1 bis 3 Minuten im Inkubator, nehmen Sie den Kolben häufig heraus und beobachten Sie die Zellablösung mit dem Mikroskop. Wenn sich die Endothelzellen zu runden beginnen, klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um sie zu lösen.

Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie 10 Milliliter DMEM-comp in den Kolben geben. Der Kolben wird einige Male mit dem Medium gespült und die Endothelzellsuspension aspiriert, die nun für andere Zwecke verwendet werden kann. Geben Sie 10 Milliliter DMEM-comp in den Kolben und überprüfen Sie ihn unter dem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Perizyten noch vorhanden und am Boden befestigt sind. Setzen Sie dann den Kolben wieder in den Inkubator ein, damit die mit Perizyten angereicherte Kultur wachsen kann.